关于举办“CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术”的通知

江苏.南京 2016年9月21-23日 (理论与实验相结合)

作为基因组靶向改造（敲除和敲入）的遗传学手段，基因组编辑技术历经ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9，已发展成为自20世纪70年代生物技术时代开启以来最重要的基因工程技术。因没有物种限制、简单、高效，以CRISPR/Cas9为代表的基因组编辑技术已广泛应用于人、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、猪、羊、水稻、小麦和拟南芥等动植物（细胞）以及细菌等微生物的基因组靶向改造，成为后基因组时代的功能基因组研究、动植物品种改良、疾病模型建立以及基因治疗等不同领域研究与应用的利器。

为让更多从事医学和生命科学事业的研究人员及时掌握基因组靶向修饰新技术、交流使用心得，更高质量地完成科研任务，定于9月下旬在南京举办以CRISPR/Cas9为主要内容的基因组靶向修饰技术。

届时，将聘南京大学知名教授为各位学员系统讲解基因组编辑知识，并聘请专业技术人员指导完成基因组编辑实验。学员除在全面了解基因组编辑理论知识之外，均可在专业人员指导下，独立完成以CRISPR/Cas9技术进行基因组编辑研究的系列实验；参会人员更可提前准备好自己科研中遇到的问题，通过三天现场的 “讲座 + 实验 + 答疑”的学习和交流，有机会全面掌握CRISPR/Cas9技术应用的方法及技巧；同时免费获得一份CRISPR/Cas9三合一对照质粒（可同时表达人源化Cas9、绿色荧光蛋白筛选标记以及表达靶向识别人p53基因的sgRNA）。

日程安排

9月21 上午9:00-12:00

理论一、基因组靶向修饰技术简介

1、基因功能研究的分子遗传学技术简介 2、基于NHEJ修复的基因敲除和基于HR修复的基因敲入

3、ZFN和TALEN技术 4、CRISPR-Cas9技术 5、NgAgo技术的争议

理论二、CRISPR（sgRNA）的设计原则

1、目标基因结构及功能的生物信息学分析 2、gRNA的设计原则 3、靶向修饰基因的基因型确认

实践1：CRISPR（sgRNA）的在线设计（请自带可无线上网之笔记本电脑或手机）（在线互动设计演练）

9月21下午13:00-17:00

理论三、sgRNA和Cas9的体外表达和体内（动物、植物、细菌）表达

1、sgRNA的体外及体内表达 2、Cas9的体外与体内表达

实验一：目标基因的基因型确认和基因组编辑等位基因的基因型鉴定（1）

1、基因组DNA模板制备 2、目标基因的基因组DNA片段的PCR扩增

实验二： CRISPR体内表达质粒（同时含Cas9、sgRNA、筛选标记等表达构件的All-in-One质粒）的构建（1）

1. gRNA模板的退火 2、退火gRNA模板与线性化CRISPR/Cas9 All-in-One载体的重组

3、转化 4、转化子的涂板培养

9月22 上午9:00-12:00

理论四、sgRNA活性验证

1、Indel突变检测的基本策略 2、基于受精卵（胚胎反应器）活性验证方法 3、基于细胞系活性验证方法

实验三：目标基因的基因型确认和基因组编辑等位基因的基因型鉴定（2）

电泳检测: 目标基因的基因组DNA片段是否可有效扩增？经基因组编辑的等位基因的扩增片段大小是否改变？

实验四：CRISPR表达质粒（同时含Cas9、sgRNA、筛选标记等表达元件的All-in-One质粒）的构建（2）

1、表达sgRNA阳性转化子的快速验证（PCR法） 2、电泳检测: 含sgRNA目标基因的DNA扩增片段大小确认

9月22下午13:00-17:00

实践2：实验结果的点评与讨论

1、目标基因的基因型确认和经基因组编辑的等位基因的基因型鉴定之电泳结果评论

2、CRISPR表达质粒之阳性转化子鉴定的电泳结果评论 3、测序是验证实验结果的金标准

理论五、利用CRISPR技术创建基因组编辑人及动物细胞系

1、创建基因组编辑细胞系的基本过程 2、用于基因敲入的供体DNA的设计原则

3、表达CRISPR的All-in-One质粒（和供体）导入细胞系的方法（脂质体转染，电转，病毒转导）

4、阳性细胞克隆筛选 5、靶向突变的基因型鉴定及基因组编辑细胞系的建立

6、敲入基因和敲除基因（无效等位基因）的确认 7、建立基因组编辑细胞系的优选策略

实践3：基因敲入供体设计举例

实践4：测序结果举例点评与讨论

1、如何阅读测序结果（文本格式结果和图形格式结果） 2、目标基因的基因型确认之测序结果评论

3、CRISPR表达质粒阳性转化子确认之测序结果评论 4、靶向突变细胞系的基因型鉴定之测序结果评论

9月23 上午9:00-12:00

理论六、利用CRISPR技术创建基因敲除或敲入动物

1、创建基因组编辑动物突变体的基本过程

2、sgRNA/Cas9 mRNA（和供体）共显微注射入受精卵中建立初建者（Founder）

3、初建者体细胞携带靶向突变等位基因的确认 4、基因敲除（基因敲入）动物（F1）的鉴定

5、基因敲除（基因敲入）动物品系（F2）的建立 6、敲入基因和敲除基因（无效等位基因）的确认

7、建立基因敲除或敲入（基因打靶）突变体动物的优选策略

实践5：测序结果举例点评与讨论

1、目标基因之基因组DNA片段的偏好性扩增 2、PCR动物靶向突变个体的基因型鉴定之测序结果评论

理论七、利用CRISPR技术创建基因敲除植物

1、创建基因组编辑植物突变体的基本过程 2、双元载体的转染 3、基因敲除（基因敲入）植物（F1）鉴定

理论八、基因组编辑技术的脱靶问题

1、脱靶的产生原因 2、脱靶检测 3、解决脱靶问题的方法 4、脱靶问题对不同领域研究者的意义

9月23下午13:00-15:30

理论九、利用CRISPRi或CRISPRa技术调控基因在细胞中的表达

1、dCas9的特征简介 2、运用CRISPR技术调控基因在细胞中表达的基本实验过程

3、CRISPR技术的转录抑制 4、CRISPR技术的转录活化

理论十、CRISPR技术的伦理学问题

1、CRISPR技术的应用

1.1 功能基因组研究---更多的基因组编辑工具的发明 1.2优良经济性状动植物新品种的选育

1.3人类疾病的动物模型的建立 1.4 基因治疗

2、基因组编辑技术对未来社会的革命性的影响

3、基因组编辑技术的伦理学问题

【主办单位】

上海玮瑜生物科技有限公司

【协办单位与媒体支持】

生物加平台

【时间地点】

2016年9月21-23日南京浦口经济开发区永宁低碳谷

【住宿】

为了便于接送、统一指定南京龙华大酒店，住宿自理

标准间（含早）298元/人合住149元/人南京浦口区江浦街道龙华路2号近南京工业大学浦口校区

【收费标准】

3300元/人 (不含住宿费) 授课期间发放纸质邀请函（盖章）按交费先后顺序确定名额及座位，注册费包含教材、午餐等费用。