原创 | 告别孤独：新技术为蛋白寻找小分子配体

这一期的《细胞》杂志发表一篇化学生物学大牛Cravatt及合作者发表的一篇为蛋白寻找小分子配体的文章。这个研究使用两个关键技术，只筛选了14个分子片段就为一千多个以前没有已知小分子配体的蛋白找到配体。利用这两个技术和只有450个片段的小化合物库他们还找到一个控制脂肪合成的关键靶点。这个技术有望令使用化学手段发现、确证靶点更加主流化。

现在发现靶点的主要手段是基因学手段，如RNA敲低、基因敲除等。最近CRISPR大规模基因敲除正成为发现新靶点的一个流行技术。但是基因敲除技术不能分辨表达后不同修饰蛋白的功能。如粉状蛋白虽然在基因学显示与阿尔茨海默有关，但不知是哪种粉状蛋白。结果制药工业翻个底儿掉现在也没找到关键介入点。当然这些基因技术也有其它问题，很多基因学发现不能用药物（小分子或抗体）重复，所以用化学手段发现和确证靶点很重要。

这个研究使用两个关键技术。一个是光化学偶联联合点击化学，把与配体结合的蛋白从大量没有结合的蛋白粥里捞出来或被荧光标记。这个技术把需要筛选的片段接到一个含有卡宾前体和一个炔基的分子结构上。这个卡宾前体本身稳定，但可以被紫外线激活生成卡宾与蛋白的碳氢键反应，把整个分子接在蛋白上。所以可以等化合物进入细胞后再用紫外线激活。炔基则可以与接在树脂或荧光化合物的叠氮基团在细胞环境下反应。

因为卡宾前体加那一个炔基也可能与部分蛋白结合造成噪音，所以作者用另一个关键技术，即同位素标记对照蛋白消除噪音。他们用正常细胞与被筛选化合物反应，用富含碳13标记蛋白的细胞与对照化合物（只有卡宾前体和炔基）反应。这些实验都在未被打碎的细胞内进行，所以很接近真实生物过程。然后把这两类细胞打碎、混合、分离蛋白、用质谱比较被筛选化合物烷基化了哪些蛋白。

利用这两个技术作者发现这14个分子片段可以与大量不同类型蛋白结合。因为这些化合物与蛋白通过共价键连起来，所以通过多肽片段分析可以找到结合位点。与这14个片段结合蛋白居然有83%没有已知配体。这些分子都很简单，所以这些蛋白之所以没有已知配体可能是因为它们没有可靠的生物学功能，否则要通过HTS筛也应该能找到这14个片段的类似物作为配体。但这正是这个工作的意义，即用小分子研究这些蛋白的功能。

某个蛋白有了有一定结合能的配体后，这个配体可以作为探针（通常用荧光标后和新化合物竞争与蛋白的结合）来寻找选择性、活性更好的化合物，这是先导物优化的常用技术。因为这14个片段与1000多蛋白结合，所以选择性肯定是不好。作者挑了两个蛋白（PTGR2和SLC25A20）作为例子确实找到了活性更好的配体。这些高质量配体则可以更可靠地研究这些蛋白的生物功能。

这个技术组合的另一个应用是细胞筛选后确定寻分子靶点。作者用一个稍大的化合物库在整体细胞水平筛选脂肪合成抑制剂。通过一系列精巧的对照试验，只有一个分子靶点（PGRMC2）可以解释苗头化合物的脂肪抑制功能。所以PGRMC2可能成为糖尿病、脂代谢失调新药的一个新靶点。

这个技术因为需要一个卡宾前体和一个炔基，所以只能筛选分子量较小的片段，否则过膜可能成为一个障碍。但这个工作只用了十几个结构类型就为上千蛋白找到配体，如果扩大化合物库应该会为更多蛋白找到伴侣，所以还是威力非常巨大的靶点发现技术。