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司端运

天津药物研究院研究员，释药技术与药代动力学国家重点实验室常务副主任，中国药理学会药物代谢专业委员会秘书长，CFDA新药审评专家，天津市安全评价研究中心党支部书记、副总经理。中国药学会系列期刊《药物评价研究》副主编等。2008年被评为天津市优秀留学回国人员，2009年被授予天津市劳动模范光荣称号，2010年被中国科协评为全国优秀科技工作者。

DBS法与传统采样法用于人体药物代谢动力学试验的比较研究

干血点采样（DBS），是将全血样品点在特制卡纸上的一种生物样品采集新技术，比传统方法具有很多优势，并可节省大量研究经费[1]。DBS 法与液质联用技术在药物定量分析中已成为一个重要方法，但还不够完善[2-3]。

       本试验采用 DBS 法与传统静脉血浆采样法同时取样，比较分析热毒宁注射液中栀子类成分，在健康人体内的药时曲线和药代参数，从而为 DBS 法的推广应用提供参考。

1 材料

1．1 药品与试剂

热毒宁注射液：每支 10 m L，江苏康缘药业股份有限公司生产，生产批号 130410。栀子苷：含量 99．7％，中检所，批号 110749－201115，山栀苷：含量 98．36％，中检所，批号 100825，京尼平龙胆双糖苷：含量 98．25％，中检所，批号 100422，桃叶珊瑚苷（内标）：含量 99．5％，中检所，批号 111761－200601。甲醇、乙腈均为色谱纯。
1.2 仪器

美国AB Sciex 公司，API 5500 型液相色谱－三级四极杆质谱联用仪，配有电喷雾离子源（ESI）；日本 Shimadzu 公司液相色谱系统。梅特勒－托利多公司 XS－105 型分析天平。美国 Thermo 电子公司 17R 型冷冻离心机。美国 Zymark 公司 TurboVap LV 型样品浓缩仪 。 北京踏锦科技有限公司VX－Ⅱ型 Targin Tech 多管涡旋振荡器。

2 试验方法

2.1 受试者的选择

纳入标准[4]：1）健康志愿者，男女各半。2）年龄：18～40 岁。3）体重指数在 19~24 范围内[体重指数=体质量（kg）/身高 2（m2）]，且男性体质量 60～70 kg、女性体质量 50～60 kg。4）体格检查及理化检验指标均在正常范围。5）志愿签暑知情同意书。

排除标准：1）3 个月内用过已知对人体脏器有损害的药物。2）近 1 周内正在应用其他预防或治疗药物者。3）最近 3 个月献血者及试验采血者。4）怀疑或确有酒精、药物滥用史。5）妊娠期、哺乳期及准备妊娠妇女。6）法律规定的残疾患者。7）根据研究者判断，不宜参加试验者。16 位健康受试者，经全面体检，血尿便常规、肝肾功能、心电图以及血液分析正常，符合试验要求。受试者于试验期间食用统一标准餐，试验期间不得饮用碳酸饮料、咖啡、茶叶水等，避免剧烈运动。
2.2 给药方法及样本采集

受试者于试验前 1 d晚入住Ⅰ期临床试验病房，禁食过夜 10 h 以上，次日晨起进食标准清淡早餐，8∶00 时静脉输注热毒宁注射液 20 m L，以 20％葡萄糖注射液稀释至 250 m L。使用输液泵控制恒速滴注 90 min 完毕，滴速为 3 m L/min。选择静脉输注给药前，静脉输注过程中 0．5、1、1．5 h，静脉输停药后 15、30、45 min、1、1．25、1．5、2、3、4、6、8、12、24 h 从志愿者肘静脉取血，每次 3 m L。
2.3 血样及样品处理

志愿者肘静脉取血 3 m L 至肝素采血管，上下摇匀，吸取 40 μL 全血点卡 2 份（双样本，卡片放于室温下 2 h 内自然晾干，然后装入已加有干燥剂的封口袋中于 4 ℃密封保存）。剩余全血以 3 000 r/min 离心 10 min，分离血浆，吸 1 份50 μL 于 EP 管中，再将剩余的血浆全部转移到另一EP 管中，血浆样品直接冻入-80 ℃冰箱保存。吸取50 μL 血浆或空白血浆，50 μL 甲醇或 50 μL 栀子3种成分系列混合标准工作液/QC 工作液，100 μL内标桃叶珊瑚苷（2 μg/m L）甲醇溶液，涡旋 1 min，4 ℃12 000 r/min 离心 10 min。取上清液 100 μL 加 50 μL去离子水，涡旋 1 min，吸取100 μL 至内插管，进样10 μL 进行 LC－MS/MS 定量分析。从全血点卡上，用打孔器打 6 mm 全血纸片至2 m LEP 管中，加入 400 μL 内标桃叶珊瑚苷（320 ng/m L，甲醇∶水＝70∶30 配制）溶液，超声 30 min，吸取上清液300 μL，40 ℃氮气吹干，用 100 μL 复溶溶液（甲醇∶水＝50∶50） 涡旋 1 min 复溶4 ℃ 12 000 r/min 离心 5 min，进样 10 μL 进行 LC－MS/MS 定量分析。精密称取栀子苷标准品、山栀苷标准品和京尼平龙胆二糖苷标准品 5.00、4.99、5.00 mg，分别置于3 个 5 m L 的容量瓶中，甲醇定容至刻度，分别获得1mg/m L 的栀子苷、山栀苷、京尼平龙胆二糖苷 3 种标准品储备液[6]。用甲醇配制栀子 5 种待测成分的混合标准贮备液，随后用甲醇梯度稀释成浓度为0．01/0．005（栀子苷浓度为 0.01 μg/m L，山栀苷、京尼平龙胆二糖苷浓度均为 0.005 μg/m L，以下同此0.02/0.01、0.1/0.05、0.5/0.25、2/1、10/5、25/12.5 μg/m L的栀子 3 种成分混合标准系列工作液。精密称取桃叶珊瑚苷（内标）标准品 4．46 mg 于 10 m L 的容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得桃叶珊瑚苷浓度为 446μg/m L的标准贮备液，并进一步用甲醇稀释为 2 μg/m L 的标准工作溶液。所有溶液置于 4 ℃保存备用。应用 LC-MS/MS 方法测定人血浆中栀子苷、山栀苷以及京尼平龙胆双糖苷的含量。人血浆中栀子苷定量分析的线性范围为 0.01~25 μg/ml，LLOQ 为0.01 μg/m L，人血浆中山栀苷和京尼平龙胆双糖苷定量分析的线性范围为 0.005~12.5 μg/m L，LLOQ 为0.005 μg/m L。在低、中、高 3 
个浓度水平下批内精密度（RSD）小于 5.38%，批间精密度（RSD）小于 8.30%，准确度（RE）在 0.5%~7.4%之间。栀子苷等成分的基质效应在 96.5%~104.0%之间，回收率在 94.7%~98.8%之间。应用 LC-MS/MS 方法测定 DBS 样品中栀子苷、山栀苷以及京尼平龙胆双糖苷的含量。DBS 样品中栀子苷定量分析的线性范围为 0.02~25 μg/m L，LLOQ 为 0.02 μg/m L，DBS 样品中山栀苷和京尼平龙胆双糖苷定量分析的线性范围为 0.01~12.5 μg/m L，LLOQ 为 0.01 μg/m L。在低、中、高 3 个浓度水平下批内精密度（RSD）小于 5.00%，批间精密度（RSD）小于 11.8%，准确度（RE）在 3.0%~12.0%之间。栀子苷等成分的基质效应在 93.5%~104.0%之间，回收率在 97.1%~116.0%之间。
2.4 测定栀子苷等成分的色谱与质谱条件

色谱柱：Ecosil C18（150 mm×4.6 mm）。
流动相：A 甲醇，B20 mmol/L 甲酸铵，0.1% 甲酸，10%甲醇 。梯度：0 min~7 min，85% B→60% B；7 min~9 min，
60% B→20% B；9 min~11 min，20%B→20% B；11 min~11.1 min，20%B→85% B；11.1 min~15 min，85% B。 流速：0.5 m L/min，保留时间：桃叶珊瑚苷 4.53 min，山栀苷5.44 min，京尼平龙胆二糖苷 8.01 min，栀子苷 9.68 min。卷帘气：14 psi，碰撞气：8 psi，喷雾电压：4 500 V，源温度：500℃Gas1：80 psi，Gas2：40 psi，入口电压10 V，碰撞出口电压：10 V，质谱运行采集时间：11 min。

2.5 数据处理

根据试验中测得的各受试者的血药浓度-时间数据绘制各受试者的药-时曲线及平均药-时曲线，进行药物代谢动力学参数的估算求得药物的主要药物代谢动力学参数[7]，包括：达峰时间（Tmax，实测值）、峰浓度（Cmax，实测值）、平均浓度-时间曲线下的面积（AUC0-t）、药时曲线下总面积（AUC0-）、表观分布容积（Vd）半衰期（t1/2）、平均驻留时间（MRT0-t）、总清除率（CL）等，采用 Win Nonlin 6.3 软件进行分析，并对计量资料进行配对 t 检验分析。

3 结果

3.1 栀子苷、山栀苷、京尼平龙胆双糖苷人血浆和DBS 法血药浓度比较 见表 1。
3.2 栀子苷、山栀苷、京尼平龙胆双糖苷人血浆和DBS 法药代参数比较 见表 2。

4 讨论

        热毒宁注射液由青篙、金银花、桅子组成，具有69清热、疏风、解毒之功，用于外感风热所致的高热、微恶风寒、头痛身痛、咳嗽等症，是治疗上呼吸道感染的纯中药注射剂，其中栀子苷与绿原酸做为质量检测指标
[8]。但其中绿原酸类成分由于在空气中易于氧化、不稳定，无法用于 DBS 法的含量检测，故仅选择栀子苷类成份进行比较分析。
中药药物代谢动力学研究，较化学药物的研究更为困难，一直是研究的热点和重点问题[9]。液相色谱串联质谱联用，使得分析速度快、选择性好、简便、精确、灵敏度高的特点，适用于多组分药物代谢动力学研究 [10]。健康受试者单次静脉滴注热毒宁注射液，
      DBS法测定 3 种栀子成分的全血浓度经血细胞比容校正后，栀子苷、山栀苷、京尼平龙胆双糖苷的 Tmax分别为 1.41、1.47、1.47 h；Cmax别为 4.58、0.285、0.550 μg/m L；AUC0-t分别为 9.06、0.638、1.20 （μg·h）/m L；MRT0-t分别为 1.52、1.49、1.45 h；CL 分别为 2.06、32.3、17.2 L/h；Vd 分别为 11.7、51.9、29.3 L；t1/2分别为 3.98、1.13、1.20 h。与文献报导的动物试验结果有差异[11-14]。山栀苷、京尼平龙胆双糖苷血浆法和 DBS 法（校正后）计算的血药浓度和药代参数较为一致，栀子苷的血药浓度数据从给药结束后 1 h 起开始出现差异，从 3.1 可以看出，DBS 法测定的血药浓度要高于血浆法的测定结果，从药时曲线上看，DBS 栀子苷的消除下降趋势变缓，因此导致 t1/2、AUC0 -t、MRT0-t均明显高于血浆法的计算结果，产生这一结果的原因还需要进一步的研究。

本文为司端运老师于2015年2月份发表在《天津中医药》的文章，2017年8月5-6日在《第二届中国药物发展与合作泰达论坛》上，我们将有幸继续聆听司端运老师就“药物临床试验生物样本分析过程管理与控制”的专题解读！
2017年8月5-6日，司端运老师与您不见不散！