（作者： 马大程 来源：生物极客）
生物极客导读：
Church 近期在起实验室网站上公布了一份手稿，来自大名鼎鼎的Editas Medicine的首席技术官Vic E. Myer与著名科学家GM Church联合发文
“The experimental design and data interpretation in “Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo” by Schaefer et al. are insufficient to support the conclusions drawn by the authors”
Schaefer等人在“体内CRISPR-Cas9编辑后意外突变”中的实验设计和数据解释。不足以支持作者得出的结论，详细剖析了近期Schaefer等人在Nature Methods上发表的文章。质疑相应的实验设计与数据的可靠性。
文章全文详情：
编辑：
您好！
Schaefer自然方法最近的信函已经获得了极大的关注，他们所得出的重磅结论与现有的使用类似的分析方法的许多文章相反，作者认为，CRISPR-Cas9系统在不被gRNA靶向的基因组区域中具有高度诱变性。 我们认为，从这项研究得出的结论，由于所设计和实施的实验所揭示的结论并不成立。 此外，不可能将观察到的受试小鼠的差异归因于CRISPR本身的作用。 在比较分析中看到的遗传差异可能在CRISPR编辑之前存在。
在我们看来，Schaefer等人的实验，观察和随后的结论可以归纳如下。使用基于CRISPR的基因组编辑在受精卵阶段创建的两只小鼠与单一的“共同安置的无CRISPR介导的校正的FVB / NJ小鼠”相比，显示出在整个基因组大量单核苷酸变体（SNV）和插入和缺失（ indels）。两个独立产生的CRISPR编辑的小鼠共有的突变数为1,397个SNV和117个插入片段。令人惊讶的是，这些明显的突变全部来自基因组中与gRNA的同源性差（在5％-65％之间）的序列。此外，50个最接近，预测的脱靶位点（基于gRNA序列同源性）中没有一个具有任何观察到的活性（SNV或indel）。作者推测，存在一个未报告的活动，其中“某些sgRNA可能在体内独立于其靶标靶向基因座”。
我们认为，从本研究得出的结论不被揭示的实验所证实，并且不可能将观察到的受试小鼠的差异归因于CRISPR本身的影响是基于以下观察结果：
首先，研究对象的总数很低（n = 2个处理的小鼠，n = 1个未处理的小鼠），并且施用于经处理和未处理的小鼠的测序深度不相等。 试图了解科学观察的统计重现性和可靠性时，数据不充分的研究可能会成为限制性的。
其次，选择共同宿主的小鼠（与父母或真正的同窝同胞相反）作为对照不足以将观察到的治疗小鼠和对照小鼠之间的差异归因于CRISPR。 实验的设计使得作者不可能排除实验动物和单个对照之间报告的基因组差异在CRISPR实验操作之前存在的可能性。 事实上，出版的文献显示，同窝同胞基因组的差异通过全基因组测序（WGS）分析可以显著（985个SNVs被鉴定）。 这些差异归因于在繁殖群体内由正常孟德尔遗传传播的突变。 在Oey等人中，通过测序方法对父母的进一步分析证实，这些SNV中绝大多数存在于父母中，少部分出现在后代的单独变异。
为了控制近交系小鼠在核苷酸水平上不完全相同的现实，适当控制的实验将包括必需组分，例如：1）母本动物的测序以确定进入实验的输入基因组序列，2）育种使用CRISPR编辑的小鼠去除嵌合体，以及3）使用相同的方法从相同的实验方案产生和表征小鼠，但缺少关键的个体成分，以排除方法本身是诱变的可能性。应将与质粒（编码sgRNA）+单链DNA寡核苷酸（ssODN）供体DNA + Cas9蛋白质产生的小鼠与用质粒+ ssODN供体，质粒+ Cas9蛋白和ssODN供体+ Cas9蛋白质产生的小鼠进行比较。这可以控制这些成分中的任一个单独地或产生小鼠的过程本质上是致突变的可能性。类似的研究已经在同一期刊上发表，使用适当的对照，并发现显着降低的SNV和indels表明实验差异，而不是CRISPR，可能是Schaefer等人最近观察到的原因。
此外，我们将强调Schaefer等人报道的以下观察结果。
1 当通过gRNA特异性预测算法运行时，在所公开的实验中使用的具体gRNA显示出对目标的高倾向，通过1个核苷酸匹配鉴定1个不同于小鼠基因组的脱靶位点，1个不同靶位点通过2个核苷酸匹配的小鼠基因组和通过3个核苷酸匹配与小鼠基因组不同的24个脱靶位点。虽然可能为研究目的而接受，但具有预测的高脱靶细胞谱的gRNA将被立即排除作为治疗候选物。尽管目标活动的高倾向性，我们发现令人惊讶的是，这种gRNA使用本研究中使用的方法，没有显示任何预测的脱靶，这强调了经验地预测和测试脱靶活性的重要性。
尽管认为SNV是在单独的合子中产生的，但在两个CRISPR编辑的小鼠中发现的大多数外显子SNV不仅在这些小鼠之间共享，而且在位置和核苷酸组成中也表现出相同的核苷酸变化。此外，尽管这些是马赛克动物，但“正常”至“突变体”等位基因计数比几乎相同。两种动物在相同基因组位置处的相同核苷酸变化是纯合的或杂合的。这强烈地表明绝大多数这些突变存在于原始动物中。在几乎每种情况下，完全相同基因完全相同基因完全相同位置发生的确切核苷酸变化的几率实际上为零。
总之，我们的观点是，作者没有充分控制研究，以这样一种方式可以得出结论，CRISPR诱导观察到的突变。 在我们看来，在比较分析中看到的遗传差异可能在用CRISPR编辑之前存在。 我们鼓励作者对适当控制的实验进行跟踪，因为理解和控制CRISPR技术的特异性对研究至关重要，对治疗发展至关重要。 我们坚定地致力于严格，客观和全面地评估我们自己的工作中的特异性，并提出在如何最佳评估这一关键参数方面的共同理解，将基于CRISPR的药物引入基因定义或 遗传可治疗疾病。
Authors:
Anne Bothmer1Morgan L. Maeder1 Deepak Reyon1 Christopher J. Wilson1 Cecilia Cotta-Ramusino1 Cecilia A. Fernandez1 Eugenio Marco1
Luis A. Barrera1 Hariharan Jayaram1 Charles F. Albright1 Gerald F. Cox1 George M. Church2 Vic E. Myer1,3
1. Editas Medicine, 11 Hurley Street, Cambridge, MA 02141
2. Harvard Medical School, Boston, MA, USA
3. Corresponding Author
药时代 祝愿朋友们：
研发奋斗一万天，上市之时仍少年！