会议大咖|刘泽源老师：青蒿琥酯片在健康人体中的生物等效性研究

青蒿琥酯片在健康人体中的生物等效性研究

青蒿琥酯片主要成分为青蒿琥酯，为青蒿类的有效衍生物。青蒿素类药物的抗疟机制之一是与活性氧有关。活性氧的产生导致原虫膜系统的损害，从而原虫代谢功能紊乱直至死亡[1-2]。青蒿琥酯的代谢产物双氢青蒿素也具有活性，因此，也要评价分析。桂林南药股份有限公司生产的青蒿琥酯片 50 mg 及 100 mg 已在国内上市 [50 mg 规格已获得世界卫生组织（WHO）的供应商资格认证 ] 根据 WHO 及我国相关法规的要求，现进行每片含青蒿琥酯 100 mg 与每片含青蒿琥酯50 mg 的青蒿琥酯片在健康成年男性受试者的人体生物等效性，同时评价青蒿琥酯片在健康成年男性受试者中的安全性，为青蒿琥酯100 mg 规格获得 WHO 的供应商资格认证提供依据。

1.1　试药
　　受试制剂：青蒿琥酯片（桂林南药股份有限公司；规格：每片含青蒿琥酯 100 mg；批号：AS111106）；参比制剂：青蒿琥酯片（桂林南药股份有限公司；规格：每片含青蒿琥酯 50 mg；批号：AS111104）；青蒿琥酯对照品（欧洲药品质量管理局，批次14228，纯度：99.8%）；双氢青蒿对照品（欧洲药品质量管理局，批次：13224，纯度：100%）；青蒿素（内标，日本 Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd， 批 号：72KJB，HPLC，纯度＞ 97.0%）；甲醇（赛默飞世尔科技有限公司，批号134191，纯度：99.9%）；乙腈（HPLC级，Duksan，Korea）；甲酸铵（AR 级、Duksan，Ko-rea）；试验用水为去离子水（本实验室自制）；Oasis HLB（1 cc，30 mg，Waters，USA）；其他试剂均为分析纯。
1.2　仪器
　　高效液相色谱 - 串联质谱联用仪（包括 Waters 高效液相色谱系统和 Q-Trap 5500，AB Sciex，USA），数据处理软件 Analyst 1.5.1（AB Sciex，USA）。色谱柱：Sun Shell C18 column（2.1 mm×50 mm，2.6 μm，Japan）；GL-88B  旋涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；XD105R 十万分之一电子分析天平（中国上海梅特勒 - 托利多）；低温离心机（3K30，Sartorius，Germany）；Milli-Q Plus  纯水器（美国密
理博中国有限公司）。

2.1　受试者选择
　　本研究入选的 36 例中国男性健康受试者中 31例为汉族，4 例为蒙古族，1 例为回族，平均年龄为（23.69±2.72）（20 ～ 29） 岁， 身高（1.69±0.06）（1.58 ～ 1.89）m，体重（59.62±7.49）（50.0 ～ 80.4）kg，体重指数为（20.8±1.6）（18.1 ～ 24.0）kg·m－ 2。试验前病史询问、体格检查和实验室检查未发现异常。试验经军事医学科学院附属解放军 307 医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。全部试验在Ⅰ期临床试验病房和医护人员监护下进行。
2.2　试验方案和血样采集
　　本试验采用随机、双周期、自身交叉的试验设计，单次口服给药，36 例受试者按随机数字分为 T、R 组，每组受试者每次试验时分别单次口服受试制剂或参比制剂 200 mg。
　　受试者于用药前一日入住Ⅰ期临床试验病房，统一进清淡平衡膳食，保证基本热量在每日 2000 ～ 3000 卡。服药前一日晚餐后禁食不禁水至少 10 h，次日晨起空腹口服给药，服药前采空白血样 5 m L。服药后 2 h 可饮水，4 h 后进统一清淡午餐。由研究者或医护人员按照预先的试验设计，根据受试者所在分组，发放试验用药，以 200 m L 温开水送服。给药剂量：受试制剂（T）：青蒿琥酯片 100 mg/ 片，2 片；参比制剂（R）：青蒿琥酯片 50 mg/ 片，4 片。血样采集：分别于给药前（0 h）、给药后 10、20、30、45min 和 1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、10、12、16、24 h 各采集静脉血 5 m L 左右置于肝素处理的试管中，静置约 30 min 后，3000 rmin－ 1离心 10 min，分离血浆；血浆样本置－ 20℃冰箱保存。
2.3　色谱 / 质谱条件
　　 色 谱 柱：Sun Shell C18柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm）； 柱 温 40 ℃； 流 动 相：A：10 mmol·L－ 1甲酸 铵；B： 乙 腈； 梯 度 洗 脱：40%B（0.15 min），40% ～ 95%B（0.15 ～ 2.6 min），95%B（2.6~3.5 min），95% ～ 40%B（3.5 ~3.7min），40%B（3.7 ～ 5 min）。流速：0.35 m L·min－ 1；进样量：2 μL；自动进样器温度：4℃。
　　离子源为电喷雾电离源（ESI），正离子方式检测；源喷射电压为 5000 V，源温度为 550℃。扫描方式为多反应监测（MRM），用于定量分析的离子对分别为m/z 402 → 163（青蒿琥酯）；m/z 302 → 163（双氢青蒿素）；m/z 283 → 173（青蒿素）。
2.4　样品处理
　　固相萃取详细步骤如下：①活化：固相萃取柱预先经 1 m L 甲醇和 1 m L 0.6 mol-L－ 1乙酸活化；②上样：向 1 m L 的血浆中加入 20 μL 标准工作溶液（含有青蒿琥酯 / 双氢青蒿素 0.1/0.1、0.25/0.25、0.5/0.5、1.25/1.25、2.5/2.5、12.5/12.5、31.25/31.25、50/50 μg·m L－ 1的甲醇溶液）和 20 μL 内标溶液（5 μg/m L－ 1），涡旋 混 匀， 取 200 μL 混 合 溶 液 上 样； ③ 淋 洗：1 m L 0.6 molL－ 1乙酸淋洗柱子２次后，1 m L 甲醇 -0.6 molL－ 1乙酸（1∶4，v/v）再淋洗 1 次（该步目的是为了去除血里面杂质）；④洗脱：用 1.6 m L 乙酸乙酯 - 乙腈（1∶1，v/v）洗脱，50℃氮气挥干；⑤复溶：残留物用 200 μL 流动相复溶，14 000 r·min－ 1离心 5 min。将上清液转移至进样小瓶，2 μL 进样。
2.5　专属性试验
　　本方法特异性好，青蒿琥酯、双氢青蒿素和内标典型的 MRM 色谱图见图 1。结果表明，空白血浆中的内源性物质不干扰青蒿琥酯、双氢青蒿素和内标的测定。

2.6　线性范围
　　青蒿琥酯和双氢青蒿素的标准曲线分别为：y ＝2.71x ＋ 0.0238，r ＝ 0.9956，y ＝ 2.49x ＋ 0.0121，r＝ 0.9975，权重系数 w ＝ 1/x2，两待测物线性范围均为 2 ～ 1000 ng·m L－ 1，线性关系良好。
2.7　精密度、准确度
　　定量下限、低、中、高（2、4、50、800 ng-m L－ 1）4 个浓度中，青蒿琥酯的日内精密度（RSD）分别5.7%、3.1%、4.7% 和 7.2%，双氢青蒿素分别为 6.1%、9.4%、6.1% 和 7.5%；青蒿琥酯准确度分别为98.4%、89.8%、92.3% 和 88.0%，双氢青蒿素分别为 99.4%、98.8%、95.6% 和 95.8%。
2.8　稳定性试验
　　经考察，青蒿琥酯的低、中、高质控室温放置 6 h不稳定，双氢青蒿素低质控室温放置 24 h 不稳定。但是 4℃放置 24 h 均是稳定的（见表 1 ～ 2）。因此样品溶解后需存放在 4℃或更低的环境中进行处理。血浆样品经 2 次冷冻 - 解冻循环稳定，血浆品－ 70℃放置 70 d 稳定。

2.9　提取回收率与基质效应

        青蒿琥酯低、中、高浓度的提取回收率分别为（93.8±1.3）%、（103.8±1.3）% 和（105.32±2.4）%；双氢青蒿素低、中、高浓度的提取回收率分别为（97.6±1.9）%、（95.3±2.1）% 和（107.9±1.9）%；内标的提取回收率为（97.4±1.5）%；青蒿琥酯低、中、 高 浓 度 的 基 质 效 应 分 别 为（79.62±6.48）%、（85.23±3.21）% 和（99.5±3.35）%；双氢青蒿素低、中、高浓度的基质效应分别为（82.72±4.41）%、（97.2±3.2）% 和（94.0±6.1）%。

3.1　血药浓度 - 时间曲线与药动学参数
　　36 例受试者空腹口服受试制剂和参比制剂 400 mg后，青蒿琥酯和双氢青蒿素的药动学参数见列于表 3，药时曲线见图 2 ～ 3。
3.2　生物等效性研究
　　将受试制剂与参比制剂的青蒿琥酯和双氢青蒿素的 AUC0 ～ t、tmax、和 Cmax等参数作为指标，进行两药的生物等效性评价。受试制剂与参与制剂的青蒿琥酯和双氢青蒿素的 AUC0 ～ t和 Cmax几何均值比的 90% 可信区间均在 80% ～ 125%，满足生物等效性评价标准（见表 4）。tmax经非参数法检验差异无统计学意义（P＞ 0. 05）。该结果表明 2 种剂型具有生物等效性。

　　本次试验过程中未出现严重的不良反应，试验结束后血生化、血常规和尿常规检查个别指标异常，均为轻度，未采取任何措施即可自行恢复。
　　在本次试验过程中，所有受试者的凝血功能检查中，除活化部分凝血活酶时间（APTT）出异常外，其余各项（凝血酶原时间 PT、活动度凝血酶原时间比值 PTR、国际正常化比值 INR）均未出现异常，APTT
异常是否与试验药物的作用机制有关还有待进一步探索。

本研究数据显示，青蒿琥酯的低质控和高质控室温放置 6 h 不稳定，双氢青蒿素低质控室温放置 24 h不稳定。据报道[7-9]，双氢青蒿素的体外稳定性研究中，对可能介导双氢青蒿素降解的因素进行体外考察，包括：高温、高湿、强光照射、有机溶剂、不同 p H 值的缓冲溶液、正常血浆、溶血血浆（含无机 / 有机铁、Fe2 ＋、Fe3 ＋、hemoglobin 或者 hemin）和全血。结果表明，双氢青蒿素在高温、高湿和强光照射下，存在不同程度的降解，而在有机溶剂中相对稳定，但存在构型转化；双氢青蒿素在缓冲溶液中的降解是 p H 值和温度依赖的；同时，通过体外方法获得了双氢青蒿素在溶血血浆和全血中的 2 种主要的降解产物，是含过氧键的半缩醛结构，表明双氢青蒿素在生物样本中的降解可能首先发生在环状半缩醛位置，而非过去认为的过氧桥；根据其降解机制筛选高效的稳定剂，在双氢青蒿素的生物样本中（包括溶血血浆和全血）加入稳定剂（H2O2EDTA·2Na），可使其在样品分析过程（包括在室温条件 下的样品预处理过程，有机溶剂沉淀蛋白过程和仪器分析过程）保持稳定[10-11]。
　　在中国健康男性受试者中，单次口服青蒿琥酯片100 mg/ 片，2 片，安全性良好，受片剂辅料以及崩解度的影响，受试制剂与参比制剂半衰期相差 2 倍，但其他药物代谢动力学参数具有相似性，受试制剂与参比制剂具有生物等效性。

本文是刘泽源老师于2016年2月发表于《中南药学》的研究论文《青蒿琥酯片在健康人体中的生物等效性研究》，2017年8月5-6日在《第二届中国药物发展与合作泰达论坛》，我们将有幸继续聆听刘泽源老师对“肿瘤领域新药的I期临床试验设计”的专题演讲！

2017年8月5-6日，刘泽源老师与您不见不散！