张同梅，于倩，葛明盖
郭志丽，毕新岭，顾军
[摘要]
目的 探讨疗癣卡西甫丸和银屑胶囊对咪喹莫特诱导银屑病小鼠模型皮损的影响。
方法 雄性BALB /c小鼠，随机分为正常对照组、模型对照组、阴性对照组、疗癣卡西甫丸组、银屑胶囊组，以及阳性对照药物复方甘草酸苷组与地塞米松组，造模成功后予不同药物治疗2周，光镜下观察各组皮损组织形态学变化，计数炎症细胞浸润数、测量纵向表皮面积值；实时定量PCR方法检测皮损中TNF-α，IFN-γ，IL-17，IL-22细胞因子表达水平的变化。
结果 HE染色显示：与阴性对照组比较，疗癣卡西甫丸组、银屑胶囊组、复方甘草酸苷组、地塞米松组皮损厚度明显减小，表皮层较为平整，分别比较炎症细胞浸润数与纵向表皮面积值，差异有统计学意义（P＜0.05）。实时定量PCR检测结果显示，与阴性对照组相比，疗癣卡西甫丸组IFN-γ，IL-22表达水平，银屑胶囊组IL-17，IL-22表达水平，复方甘草酸苷组TNF-α，IFN-γ，IL-17，IL-22表达水平，以及地塞米松组IL-17，IL-22表达水平均明显降低。
结论 疗癣卡西甫丸与银屑胶囊对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型有明确疗效，可抑制在银屑病发病过程中起主要作用的Th1，Th17细胞通路。
[关键词] 银屑病；咪喹莫特；疗癣卡西甫丸；银屑胶囊
Effect of Liaoxuan Kaxipu Pill and Yinxie Capsule on Psoriasis Mice Model Induced by Imiquimod
ZHANG Tong-mei, Yu Qian, GE Ming-gai, GUO Zhi-li, BI Xin-ling, GU Jun
（Department of Dermatology，Changhai Hospital of Shanghai, Shanghai 200433, China）
[Corresponding author] GU Jun，E-mail:gujun79@163.com
[Abstract]
Objective To observe the effects of Liaoxuan Kaxipu Pill and Yinxie Capsule in the treatment of imiquimod induced psoriasis mice model.
Methods Male BALB /c mice were divided into seven groups randomly：Normal control(Norm.C)，Model，Negative control(Neg.C)，Liaoxuan Kaxipu Pill(LKP)，Yinxie Capsule(Y.Cap)，and Compound glycyrrhizin(Co.GH)，Dexamethasone(Dex) as two positive controls.After modeling,these 7 groups were treated with different drugs respectively for two weeks.The histomorphology changes of mice skin lesions were evaluated according to the number of inflammatory cells and longitudinal epidermis area. Expressions of TNF-α,IFN-γ,IL-17 and IL-22 were investigated by real-time PCR.
Results Compared with negative control,lesions of LKP-，Y.Cap-，Co.GH-，Dex-treated groups were thinner with more smooth epidermis, and the number of inflammatory cells and longitudinal epidermis area of these 4 groups showed significant difference.IFN-γ,IL-22 expressions in LKP-group, IL-17,IL-22 expressions in Y.Cap- and Dex-group, TNF-α,IFN-γ,IL-17 and IL-22 expressions in Co.GH-group were reduced significantly.
Conlusion Liaoxuan Kaxipu Pill and Yinxie Capsule have definite therapeutic effect on imiquimod induced psoriasis mouse model, by inhibiting Th1 and Th17 cells in the pathogenesis of psoriasis.
[Key words] Psoriasis；Imiquimod； Liaoxuan Kaxipu Pill；Yinxie Capsule；Compound glycyrrhizin；Dexamethasone
银屑病是一种常见并易复发的慢性炎症性皮肤病，属于自身免疫相关性疾病。免疫激活剂咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型在皮损形态、组织病理以及发病分子学特征等方面与人类银屑病极为相似。
疗癣卡西甫丸和银屑胶囊是维吾尔族医药治疗银屑病的代表药物，在银屑病治疗中有其独特的理论体系。本研究在咪喹莫特诱导银屑病小鼠模型的基础上，观察疗癣卡西甫丸和银屑胶囊的免疫干预作用，为其临床应用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验动物 BALB /c 雄性健康小鼠42只，8～10周龄，体重20～30g，由上海灵畅生物科技有限公司提供，动物许可证编号SCXK（沪）2013-0018，饲养于SPF级动物室。
1.2 主要药品与试剂 疗癣卡西甫丸（新疆维阿堂制药有限公司，国药准字Z20080071），银屑胶囊（新疆维阿堂制药有限公司，国药准字Z20080093），咪喹莫特乳膏（艾达乐，3M Health Care Limited，批准文号：H20100157），复方甘草酸苷片（美能，秋山片剂株式会社，国药准字J20080080），醋酸地塞米松片（天津力生制药股份有限公司，国药准字H12020122），TNF-α，IFN-γ，IL-17，IL-22引物（上海生工生物技术有限公司），GoTaq qPCR Master Mix试剂盒（Promaga），PrimeScript® 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara） 。
1.3 实验方法
1.3.1 动物模型制备 将BABL/c小鼠背部脱毛，面积约2cm×1.5cm，动作轻柔避免损伤皮肤。按随机数字表法将42只小鼠随机分为7组，每组6只，按组别分笼饲养，每日予灭菌水及普通鼠饲料喂养。
随机抽选一组作为正常对照组（Normal control，Norm.C），背部无毛区每日涂抹蒸馏水约0.5mL；其余6组背部无毛区涂以5%咪喹莫特乳膏，60mg/d（有效药物为3mg/d），连续6d，小鼠背部出现较为稳定的红斑鳞屑性皮损，则判定模型制备成功。
1.3.2 实验分组及给药 模型制备成功后，按组别分别给予不同药物处理。7个组分别为正常对照组（Normal control，Norm.C），模型对照组（Model），阴性对照组（Negative control，Neg.C）。疗癣卡西甫丸（Liaoxuan Kaxipu Pill，LKP）组，银屑胶囊（YinxieCapsule Y.Cap）组，复方甘草酸（Compoundglycyrrhizin，Co.GH）组以及地塞米松（Dexamethasone，Dex）组，其中复方甘草酸苷、地塞米松为阳性对照。
按照成年小鼠25g标准体质量，将所需药物按每日灌胃给药0.5mL标准提前配置成相应浓度的混悬液。正常对照组：不给药；模型对照组：不给药；阴性对照组：0.9%生理盐水灌胃，0.5mL/(次•天)。
其余4个药物治疗组分别给予疗癣卡西甫丸（3.03g/kg.d）、银屑胶囊（0.82g/kg.d）、复方甘草酸苷（ 227.5mg/kg.d）、地塞米松（1.02mg/kg.d）等药物混悬液灌胃，0.5mL/(次•天)，连续2周。在给药过程中，除正常对照组外，其余组别小鼠背部无毛区隔日涂抹5%咪喹莫特乳膏（60mg/d），以减少模型小鼠皮损自然缓解对本实验的干扰。
1.3.3 实验动物标本采集 实验结束后以颈椎脱臼法处死小鼠。皮肤组织活检术采集背部皮损组织，每只小鼠皮损标本分成两部分，一部分立即置于﹣80℃冰箱保存以行实时定量PCR检测，另一部分固定于10%甲醛溶液中用于制备石蜡切片，进行HE染色。
1.3.4 各组小鼠红斑鳞屑性皮损面积及严重程度观察 治疗过程中仔细观察小鼠生命体征，每日同一时间拍照记录皮损处红斑鳞屑变化情况。
1.3.5 HE切片染色法检测皮肤组织学变化 制作小鼠皮损处组织HE染色切片，观察炎症细胞浸润数及表皮厚度的变化。每张切片在显微镜×200倍下观察，采用图像处理软件放大后计数炎症细胞浸润数（个/HP）；同时采用图像处理软件，以基底膜带为界，勾划纵向表皮面积并换算成数值，该值越大，则皮损厚度越厚。
1.3.6 实时定量PCR检测皮损内TNF-α，IFN-γ，IL-17，IL-22细胞因子表达水平。取保存于-80℃新鲜小鼠皮损组织，加液氮研磨成粉末状，采用Trirol法提取RNA，使用Takara公司的PrimeScript® 1st Strand cDNA Synthesis Kit 进行cDNA合成，合成步骤根据生产商提供的说明书进行；
实时荧光定量PCR：使用Promaga公司的GoTaq qPCR Master Mix试剂盒进行qPCR反应，反应步骤根据生产商提供的说明书进行， PCR反应条件为：热启动95 oC 2min、变性温度95 oC，时间15s；退火、延伸温度60 oC，时间34s；循环40次。
1.4 统计学处理 使用SPSS18统计软件包进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（`c±S）表示，多个组间比较采用方差分析，多重比较采用SNK法。检验水准α=0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 各组小鼠红斑鳞屑性皮损面积及严重程度观察 见图1。治疗2周后，正常对照组背部皮肤正常，有毛发生长；模型对照组与阴性对照组背部皮损与正常对照组比较，红斑、鳞屑表现明显，皮肤明显增厚，与银屑病患者皮损表现相似。
疗癣卡西甫丸组、银屑胶囊组、复方甘草酸苷组、地塞米松组背部皮损红斑鳞屑较阴性对照组有改善，其中地塞米松组红斑鳞屑减少较为明显。
2.2 治疗2周后各组小鼠皮肤组织学变化 见图2~3。HE染色显示：与正常对照组比较，模型对照组与阴性对照组皮损表皮棘细胞层明显增厚，角质层角化过度、角化不全，真皮乳头血管扩张迂曲，真皮层及皮下组织炎症细胞浸润明显，与银屑病患者皮损组织学表现相似；
其余四种药物治疗组与阴性对照组比较，皮损厚度明显减小，表皮层较为平整，炎症细胞浸润也明显减少，其中疗癣卡西甫丸组、银屑胶囊组、地塞米松组皮损厚度降低更明显，地塞米松组炎症细胞减少最明显。
各组炎症细胞浸润数和纵向表皮面积值见表1。方差分析显示7个组别之间炎症细胞浸润数（F=33.98， P<0.001）和纵向表皮面积值（F=89.38， P<0.001）的差异均有统计学意义。
浸润细胞数的多重比较显示，正常对照组与其他各组均有差异，且低于其他组（P均<0.05）；阴性对照组与模型对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05），但与其他各组间均有差异，且高于其他组（P均<0.05）；四种药物治疗组之间差异无统计学意义（P均＞0.05）。
纵向表皮面积值的多重比较显示，正常对照组与其他各组均有差异，且低于其他组（P均<0.05）；阴性对照组与模型对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05），但与其他各组间均有差异（P<0.05）；各治疗组纵向表皮面积值地塞米松组＜复方甘草酸苷组＜银屑胶囊组＜疗癣卡西甫丸组，其中复方甘草酸苷组和银屑胶囊组差异无统计学意义（P＞0.05），其他各组之间差异均有统计学意义（P均<0.05）。
图1 各组小鼠2周后背部皮损形态学观察；
图2 各组小鼠皮损组织学改变( HE×200)；图3 各组小鼠皮损组织学改变( HE×400)。
Fig.1 The gross observation of back skin in mice after two weeks；Fig.2 The histological changes of mice skin lesions ( HE×200)；Fig.3 The histological changes of mice skin lesions ( HE×400)。
2.3 药物治疗2周后对小鼠皮损TNF-α，IFN-γ，IL-17，IL-22mRNA表达水平的影响（见图4）。实时定量PCR检测结果显示，模型对照组与阴性对照组四种细胞因子的表达量均远大于正常对照组表达量的两倍。与阴性对照组相比，疗癣卡西甫丸组IFN-γ，IL-22表达水平，银屑胶囊组IL-17，IL-22表达水平，复方甘草酸苷组TNF-α，IFN-γ，IL-17，IL-22表达水平，地塞米松组IL-17，IL-22表达水平均降低了一半以上。
4a, TNF-α expressions; 4b, IFN-γ expressions; 4c, IL-17 expressions; 4d, IL-22 expressions
图4 治疗2周后各组细胞因子表达水平
3.讨论
银屑病是一种免疫相关性皮肤病，其发病机制复杂，目前已知多种炎症细胞以及细胞因子参与了发病过程。早期研究表明，以IFN-γ，TNF-α，IL-6等为代表的Thl细胞因子在银屑病中水平升高[1]，银屑病的基因标记分析也显示TNF-α与IFN-γ在银屑病中起到了突出作用[2]，抗TNF-α疗法治疗银屑病也已经临床验证有效[3]。
近年来还发现Th17细胞在银屑病发病中起了很重要的作用，在银屑病皮损处，Th17 细胞及其分泌的IL-17A，IL-17F，IL-21，IL-22等细胞因子的mRNA表达量与正常皮肤相比显著升高[4]，这些细胞因子可诱导多种前炎症因子和趋化因子的产生，参与前炎性反应，募集及活化中性粒细胞[5]。
在银屑病炎症过程的下游，Th1与Th17细胞分泌的细胞因子共同作用，直接作用于角质形成细胞，使其激活、过度增殖，从而产生银屑病样皮损[6]。寻常性银屑病典型皮损组织病理表现为表皮角化过度与角化不全，棘层增厚，真表皮内炎细胞浸润数增多[7]。
咪喹莫特诱导银屑病小鼠模型是现今较为成熟的一个模型，有研究表明，该模型小鼠体内中，IL23/IL17轴在银屑病发病过程中起到了关键性作用，这与银屑病发病机制相一致[8]。
国内学者基于该模型的药效学及机制研究也表明，阿维A、地塞米松、甲氨蝶呤等临床治疗银屑病的药物对该模型也具有一定疗效[9]。
本研究中，模型对照组与正常对照组相比，小鼠皮损组织学表现与人类银屑病皮损组织病理表现极为相似，皮损中浸润细胞数也明显增多，在细胞因子水平，与银屑病发病密切相关的TNF-α，IFN-γ，IL-17，IL-22表达水平明显升高，因此笔者认为该模型可以很好地模拟人类银屑病，并用于药物作用机制研究。
维吾尔医药是祖国医药的重要组成部分，有其独特的医药学理论体系[10]。维医认为人体通过肝脏的正常功能产生四种体液，即胆液质、血液质、黏液质和黑胆质，它在人体整个生命活动中，保持一定的平衡状态。当人体气质的相对平衡受到破坏，超出人体自我调节的功能范围，生成的异常体液则会导致疾病发生、发展，当异常体液经过循环在人体皮肤某处堆积，影响皮肤的营养吸收，则会导致银屑病及其它多种皮肤疾病。
皮肤再受到真菌的侵袭，而导致皮肤癣菌病。所以调整气质，使体液恢复正常，是临床治疗的根本原则。疗癣卡西甫丸主要组分有黄连、欧菝葜根、菝葜、芝麻等，银屑胶囊主要成分为土茯苓和菝葜。两者组方成分均为维吾尔族医药治疗银屑病的经验方剂，其中共有的成分菝葜具有祛风利湿、解毒散瘀之功效[11]。
银屑胶囊中的土茯苓具有解毒除湿、通利关节的作用，与相关药物配伍治疗银屑病、类风湿关节炎等效果显著[12]，有研究表明疗癣卡西甫丸所特有的欧菝葜根[13]是新疆独有的中药材，可高效清除体内碱性异常粘液质及黑胆质等毒素，维持体内体液的平衡，加之黄连清热泻火[14]，以及芝麻的抗细菌、抗病毒、减轻刺激、促进炎症恢复的作用[15]，能有效缓解银屑病病情。
本研究旨在通过动物实验的方法，来探讨上述两种药物治疗银屑病的作用机制，并选取对银屑病有肯定疗效的复方甘草酸苷与地塞米松作为阳性对照，以此对比疗效及作用机制的差异。
经过2周的给药处理后，四个给药组在组织形态学上均有明显改善，浸润细胞数明显减少，纵向表皮面积值也明显减小，说明四种药物治疗均有较好的疗效。四种药物降低炎症细胞浸润的作用没有明显差异，在降低表皮厚度上，地塞米松疗效最佳，复方甘草酸苷与银屑胶囊次之，而疗癣卡西甫丸稍弱。
对小鼠皮损中TNF-α，IFN-γ，IL-17，IL-22细胞因子的基因表达水平检测结果显示，复方甘草酸苷对TNF-α，IFN-γ，IL-17，IL-22表达水平均表现出了良好的抑制作用，地塞米松对IL-17，IL-22表达的抑制比较明显，但是对TNF-α，IFN-γ的表达并没有表现出明显的抑制；疗癣卡西甫丸和银屑胶囊对四种细胞因子均有不同程度的降低作用，其中疗癣卡西甫丸降低IFN-γ，IL-22表达水平的作用更明显，而银屑胶囊组则是IL-17与IL-22。
由此推测，两种药物作用通路有所差别，疗癣卡西甫丸对Th1，Th17细胞通路均有一定程度的抑制作用，而银屑胶囊主要抑制的是Th17细胞通路，这或许与其不完全相同的成分有关。
综上所述，疗癣卡西甫丸与银屑胶囊对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型有明确疗效，可抑制在银屑病发病过程中起主要作用的Th1，Th17细胞，减少炎症细胞浸润，降低表皮厚度。
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