马亦蓉
上海上药新亚药业有限公司
上海 201203
摘 要：从两性霉素B的发酵工艺入手，介绍了两性霉素B的发酵工艺流程和设备流程，通过分析可能造成发酵染菌的原因，结合实际情况，确定了发酵染菌的主要原因，并制定了相应的控制措施，改进后的染菌情况大为改观。
关键词：两性霉素B；发酵染菌；原因；染菌率；措施
0 引言
虽然两性霉素B是含37个碳原子组成的大环内酯乳糖七烯类的抗生素，是治疗全身性深度真菌感染的唯一有效药物，但其副作用大、毒性大，而两性霉素B脂质体能有效弥补这一缺陷。作为两性霉素B脂质体的原料来源——两性霉素B，采用生物合成法（微生物发酵法）生产，利用两性霉素B的产生菌，在一定的条件（包括培养基、温度、pH、通气、搅拌等）下使其生长繁殖，并在代谢过程中产生两性霉素B，再用溶媒结晶法将两性霉素B从发酵液中提取出来，加以精制，最后获得两性霉素B成品。
两性霉素B的生产工艺（菌种→孢子制备→种子制备→发酵）属于发酵生产工艺。然而，发酵生产工艺要求，除大量繁殖两性霉素B的产生菌外，不允许其他杂菌（即染菌）的生长。染菌不仅消耗培养基中的营养成分，还会分泌某些对产生菌有毒性或者能使两性霉素B失去活性的物质。同时，降低两性霉素B的发酵单位，严重时会导致“倒罐”，即发酵过程中出现了较为严重的染菌现象，意味着发酵失败。因此，防止染菌，降低染菌率是发酵生产中一项长期、重要的工作。
本文从多方面入手，分析可能造成两性霉素B发酵染菌的原因，并通过制定相应的措施，降低染菌率。
1 发酵生产简介
1.1 工艺流程
两性霉素B的发酵工艺流程如图1所示。
1.2 设备流程
两性霉素B的发酵设备流程如图2所示。
1.3 关键工艺简述
将节状链霉菌（Str. nodosus）培育至生产菌株，需经种子阶段、发酵阶段的通气培养，培养基由葡萄糖等原料作为碳源、酵母粉等原料作为氮源，并添加微量元素，整个培养繁殖过程应保持严格的纯种状态。
在整个发酵过程中，需全程进行杂菌试验，以此来判断发酵过程是否染菌。通过观察菌种外观、镜检等手段来判断从一级发酵进入二级发酵（移种）的时机。两性霉素B经过发酵周期后，发酵液经酸化过滤，收集滤饼（两性霉素B菌丝体）。
2 染菌事件的调查
在两性霉素B发酵生产中发生了染菌事件，通过调查发现，其均为二级发酵间歇染菌，调查结果如表1所示，染菌情况严重，造成发酵效价低，过滤困难，只能作“倒罐”处理。
注：（1）J表示正常，无染菌；L表示已染菌；（2）染菌率=染菌批次/总批次×100%。
从表1可以看出：12批两性霉素B发酵的染菌率为50%，染菌情况严峻。
3 染菌原因分析及要因确认
两性霉素B发酵生产中的染菌原因分析及要因确认如表2所示。
在两性霉素B发酵生产的染菌事故调查中，经过染菌原因分析及要因确认后，汇总并制成染菌原因鱼刺分析图，如图3所示。
4 采取的控制措施
根据两性霉素B的染菌原因鱼刺分析图，针对引发染菌的主要原因，制定相应的控制措施，如表3所示。
4.1 空气系统中水分过多
总空气过滤器的失效多数是由空气系统中水分过多造成，若不能有效除湿，过滤介质极易失效，引起污染。针对这一情况，应落实专人负责空气系统的管理，定期检查，定时消毒，及时放出冷凝水，并对空气在进入总过滤器之前加热升温，使得相对湿度下降，然后进入总空气过滤器除菌，尽可能减少空气系统中的水分。
4.2 罐体渗漏
对发酵罐进行大范围检修，在罐体内电焊捉漏，检查夹套是否腐蚀穿孔，检查管道和连接部件安装是否合理；对罐壁、电焊缝渗漏处作相应处理，严密堵漏。
4.3 罐内设计不合理
（1）针对空气分布口偏高，影响发酵液吸收溶氧的情况，应降低空气分布板位置，使分布口高度适宜，使发酵液有效吸收溶氧。
（2）针对罐内出料管道口距罐底距离过大，影响发酵罐清洗，从而造成发酵罐染菌的情况，应把原来高度在100 mm左右出料的管道口改为基本接近罐底。
（3）针对排汽管道细，排汽不流畅，出现死角的情况，应清理旋风器，增加排汽出口，减少排汽死角。
4.4 蒸汽供应压力低或不稳定
蒸汽供应的压力稳定是保证发酵系统有效灭菌的基础。若蒸汽压力不稳定，就会因为灭菌不彻底造成污染；若蒸汽压力低，就会造成灭菌时间长，进而破坏培养基。
一般蒸汽由动力车间供应，因此，应保证足够压力的饱和蒸汽及其稳定性。
4.5 灭菌操作不到位
（1）为了提高相关操作人员的素质，应对操作人员进行SOP教育培训，并进行考核；（2）强化管理，严格要求员工按照岗位SOP操作，认真控制预热温度、罐温及维持罐内培养基温度，严格控制进料流量，保证灭菌质量；（3）抽查操作人员的工作情况，并与工资、奖金挂钩。
4.6 工艺弱点
针对消毒时液面高的现象，可提高某培养基使用比例，降低另一培养基使用比例，使消毒液面得以有效控制。
5 效果检查与对比
在针对两性霉素B的染菌主因，制定并落实了相应的控制措施后，染菌情况大为改观，染菌率直线下降，具体效果如表4所示。图4为改进前后两性霉素B的平均效价对比，图5为改进前后两性霉素B的染菌率对比。
注：（1）J表示正常，无染菌；L表示已染菌；（2）染菌率=染菌批次/总批次×100%。
从表4可以看出：12批两性霉素B发酵的染菌率为8.33%，染菌问题大有改观。
6 结语
本文从两性霉素B的发酵工艺入手，介绍了两性霉素B的发酵工艺流程和设备流程，通过分析可能造成发酵染菌的原因，结合实际情况，确定了发酵染菌的主要原因，并制定了相应的控制措施，改进后的染菌情况大为改观。
同时，建议采取以下巩固措施：
（1）制定管理标准，加强对设备等的定期检查力度，每月进行检查、维修，发现问题及时解决；
（2）修正工艺规程，并写入标准操作规程；
（3）制定岗位培训计划，对员工定期进行各项规章制度、岗位操作规程及相关文件的培训，并严格遵照执行。
[参考文献]
[1] 陈裕充，温海.两性霉素B及其脂质体的抗真菌机制[J].中国真菌学杂志，2006，1（5）：312-314.
[2] 王以光.抗生素生物技术[M].北京：化学工业出版社，2009：26-28.
[3] 熊宗贵.发酵工艺原理[M].北京：中国医药出版社，1995：38-40.
[4] 马寅姣，宋沁馨，顾觉奋.抗生素筛选方法[J].中国抗生素杂志，2010，35（9）：654-658.
[5] 贺娟.一株产大环内酯类抗真菌抗生素菌株的鉴定及发酵工艺优化[D].杭州：浙江大学，2011.
作者简介：
马亦蓉（1971—），女，上海人，工程师，从事药品生产工艺与质量管理工作。