【会议大咖】2019中国创新药物研发冠军论坛特邀专家-何玉先教授

曹志亮*   何玉先

HIV-1病毒被认定为引起获得性免疫缺陷综合症 (AIDS)的主要原因, 发现至今已有近30年的历史, 全球超过6500万人感染了HIV-1, 并且大多数感染者在发展中国家。因此研制一种安全有效并能广泛使用的HIV疫苗对于预防和控制HIV的流行具有重要的意义 [1]。然而, 诱导广谱中和抗 体 面临 着科 学障 碍, 包 括: H IV-1 病毒的高度遗传多样性, 作为广谱中和抗体靶点的保守表位相对不易接近, 包膜糖蛋白的不稳定性, 疫苗接种后维持中和抗体(Nab)滴度水平存在困难 [2-3]。对HIV-1包膜糖蛋白研究已经揭示了 该病毒具有有效的免疫逃逸机制, 且很少有/漏洞0存在。中和抗体(Nabs)的作用主要有两个, 其中一种方式是: 通 过结合到病毒粒子表面三聚体包膜蛋白上, 从而阻止病毒与其靶细胞上受体的结合; 另一种方式是: 在病毒颗粒附着到靶细胞后, 抗体再与此时的病毒颗粒结合, 从而抑制病毒 与靶细胞的融合过程。后一种情况中, 中和抗体(Nabs)可能是结合到病毒由于与其靶细胞上的受体结合而暴露出的表位上或是所触发的表位上。HIV-1已经进化出多种保护机制逃逸抗体的结合，诸如：Env的高糖基化，这些机制使非免疫原性的多糖阻止了抗体接近其识别的多肽结构; gp120-gp41 结 构形成的三聚体同样能够遮蔽敏感的表位 (这些表位在单体亚单位中则是暴露的）。

近年来的一些研究显示, 某些中和抗体可以识别Env上存在的这些 /漏洞0。已经找到了几株抗HIV-1的广谱和有效的中和抗体, 诸如 b12, 2G12, 2F5, 4E10, PG9和PG16，以及最近发现的VRC01, VRC02, VRC03。另外，来自于HIV-1感染个体的一些稀有的血清也具有广谱中和活性。这些广谱的中和单抗的存在 证实了诱导产生中和抗体的疫苗设计的可行性。近来技术的进步如在结构生 物学, 冷冻电镜的X射线的断层摄影, 计算生物学, B细胞免疫生物学, 高通量机器化的微中和筛选实验, 这些技术上的进步将为疫苗的研制提供帮助[3]。

1 抗HIV中和单抗研究

1.1 目前公认的广谱中和抗体

1.1.1 单抗b12  

人源单抗b12, 它识别gp120上与 CD4结合区相重叠的高度保守的表位 (构象表位 )。抗体b12有一个长CDR H3(18aa)环, 长CDR H3环有利于抗体探测到 gp120上CD4位点的结合槽[4]。b12 IgG形式通过阻止病毒-细胞的融合过程达到中和作用, 而b12 Fab形式则是在病毒进入细胞后的某一阶段阻止感染 [5]。这一结果提示, 同一抗体的不同形式, 可能其中和作用的机制不同。其它抗体与b12同样可以起到封阻CD4跟gp120的结合, 但他们缺乏b12 中和HIV-1病毒株的能力。为什么b12是独特的? 这些问题还有待人们去深入研究。

1.1.2 单抗 2G12   

单抗 2G12 通过独特的抗体结构识别一簇gp120上的寡聚残基。人源抗体2G12有一种/特别的 0构型, 它能与位于HIV-1 gpl20包膜表面的寡聚体甘露糖形式的决定簇进行多价相互作用。了解它的结构及与HIV 包膜蛋白结合的原理可以促进HIV疫苗研究。[6]

1.1.3 单抗2F5和4E10    

单抗2F5和4E10识别gp41胞外区近膜端区域(MPER) 相似但不同的表位。这两个中和抗体可能通过抑制融合过程起作用。2F5的识别线性表位为gp120上G lu662) A la667间的一段序列(ELDKWA) [7]。4E10识别 gp41上MPER的螺旋肽结构 (NWFDIT)。Xu等 [8]的研究发现4E10 非特异性地与膜结合, 它的中和作用是通过特异的肽或脂质体的定向改变来实现的。

1.1.4 单抗447-52D   

Stan field 等[9]报道了单抗447-52D识别 gp120 V3 环的高变区, 其识别表位为 V3 环312~315氨基酸。与其他的抗 HIV-1单抗比较, 发现447-52D同样具有一个较长的 CDR H3, 推测长的 CDR H3 可能更好地与 gp120上相应的表位发生作用。

1.1.5 其他抗体   

b12 、2G12、2F5 和 4E10这4个抗体是目前已知的最具有广谱中和作用的抗体, 除了这些公认的具有广谱中和活性的单抗外, 还有 其他一 些有关中和抗体的报道, 如针对CDi表位的X5, 17b和E51等。未来更多的具有广谱中和作用的抗体还有待我们去发现和研究。

1.2 新近发现的几株广谱中和单抗

最近新发现的几株单抗引起了广泛重视, 其中包括分离A亚型感染病人的单抗PG9和PG16 , 这两株单抗其中和HIV-1毒株的范围较 为广泛, 它们的结合位点在gp120 V1/V2 和 V3 环保守的残基上, 另外3株新发现的单抗为VRC01, VRC02, VRC03。其中VRC01可中和约 91% 的目前流行的HIV-1病毒株。VRC01作用机制是通过模拟 CD4与 gp120相互作用结合CD4结合位点。

2 对广谱中和抗体(NAbs)研究的新认识

自然HIV-1感染中, 过去我们很少了解中和抗体与HIV-1感染之间有关的临床方面的信息, 或者更多的关于这些中和抗体识别的病毒表位方面的信息。近来, 4篇报道[10-13]为这些问题提供了新的知识。Doria-Rose等[11]和Sather等[13] 研究了感染HIV-1一年以上的约占感染总数 25% 的感染者, 对这些无 AIDS临床症状也未接受过抗反转录病毒药物治疗的感染者的研究, 他们发现这些感染者体内存在适度的广谱中和抗体 (bNab) 反应。与此同时, Simek等 [14] 调查了来自1798份样本, 这些人大多数是非B亚型的感染HIV -1的患者, 同样发现了在这些患者中约1% 带有不同寻常的有效中和活性抗体, 深入研究发现这些中和抗体可以中和大多数亚型的毒株。这些研究结果表明人体免疫系统具有产生有效的抗HIV-1 bNab 的能力。

Walker等[15]近来从感染HIV的患者身上分离了两株有效的广谱中和mAbs ( PG9, PG16 )。从来自 A亚型感染的患者的约30,000 激活的记忆B细胞克隆中, 他们使用高通量中和筛查的方法分离到这两株有效的新单抗, 这两株单抗所识别的靶标为以前未曾发现过的表位。该表位位于跨越 gp120的可变环的保守区域。这一研究结果对于能诱导广谱中和抗体新疫苗的设计提供了思路。

中和抗体被认为在HIV-1疫苗保护中是至关重要的, 但先前动物模型研究中认为高抗体浓度是必要的, 这一结论对疫苗设计产生了障碍。在单一感染的实验中, 这些研究普遍地运用了大的病毒载量目的是为确保对照动物能被感染。相反, 大多数人类是经性伴侣传播而感染的, 这就可能涉及重复感染相当低剂量的病毒的情况。由此 推断, 动物研究中可能过高评估了所需抗体的滴度水平。Hessell等[16]研究了抗体适当的中和滴度能否保护源于阴道内的感染低剂量的猿猴HIV(SHIV)的短尾猴, 与先前认为的可起到保护作用的抗体滴度相比, 这项研究表明抗体在较低滴度时同样可以起到有效的保护作用。低剂量重复感染的短尾猴感染模型可能更好地模拟了人类通过异性性接触感染HIV-1的实际情况。同样地,  Hessell等[17]在另一篇文章的研究中认为，在传统的保护实验中, 大多数动物模型研究表明高血清浓度中和抗体 (bNAbs)是必须的, 但一个例外是抗多糖的中和抗体 2G12, 该单抗已经被报告可以在低的血清中和滴度上保护感染SHIV的短尾猴。相对于它的中和能力方面, Hessell等[17]的研究显示2G12在保护性方面有不同寻常的效率。

3 免疫原设计的策略

3.1 假病毒颗粒的形式展示天然包膜蛋白

在应对当前流行的HIV-1 病毒株方面, 有效的以诱导产生中和抗体的研制目前还面临着诸多的挑战。基于gp120的单体疫苗途径在诱导抗体方面还未获得成功, 这就促使寻找新的设计途径模拟存在 于病毒膜表面的天然的糖蛋白复合物。Gag-Env假病毒是非感染性的病毒粒子, 它再现了天然的包膜糖蛋白结构, 可以产生中和抗 体并在抗原始毒株方面有潜在的能力[18]。Hammonds等[19]研究中发现用 Gag-Env假病毒颗粒与相应的佐剂混合物免疫豚鼠后, 可诱导出较高水平的抗 gp120的抗体产生, 同时也可检测到相应的可 中和HIV-1原始毒株的中和抗体。该项研究为基于假病毒的疫苗在产生中和抗体抵抗HIV感染的应用提供了相关的支持。

3. 2 基于广谱中和单抗识别的表位设计免疫原

3.2.1 gp120上的 CD4 结合位点   

CD4 结合位点 (CD4bs)是诱发广谱中和抗体的主要靶点, 该区高度保守并具有可接近性。当前, 已证实单抗b12及少数广谱中和血清抗体作用的靶点即此位点[20,  21]。Corti等[21]从感染HIV-1病人身上分离到新的具有中和幅度 的单抗, 他们的结果表明HJ16 和 b12识别位点相关但该单抗的结合位点为接近CD4bs的非重叠的表位。与 b12相比, 单抗H J16展示了相似的中和幅度和结合效率但显示了不同的中和灵敏性。先前 发现的单抗中, b12是最具广谱和有效的直接针对 CD4bs的抗体, 所以一种免疫原设计策略是针对b12的识别表位来设计, gp120 上的CD4bs将成为有希望的位点。

3.2.2 辅助受体结合位点   

gp120上的辅助受体结合区域对一些血 清的交叉中和活性也起到了一定的作用 [22]。辅助受体结合区域被认为是在病毒Env结合它的主要受体 CD4 后, 在病毒-细胞融合过程中仅瞬时呈现给免疫系统的区域。这样, 抗体进入Env上的辅助 受体结合位点通常因病毒的Env靠近靶细胞质膜而受到限制[23]。事实上, 结合到辅助受体结合区的单抗不能中和HIV-1, 推测是因为它们不能有效进入到病毒三聚体Env上的这个位点[24]。因此对于辅助受体结合位点能否成为广谱中和抗体的靶点仍存在质疑, 今后需要有更直接的证据来证明。

3.2.3 gp41的近膜端外部区(MPER)    

广谱中和抗体(2F5, 4E10, Z13e1)结合到 gp41 上色氨酸富集区, 该区被称为近膜端外部区 (MPER)。MPER定位在gp41胞外区的C端, 是一个保守的对病毒 的融合至关重要的区域。Hessell等[25]最近研究发现广谱中和单 抗2F5和4E10能够在粘膜的SHIV感染中提供完全的保护, 这一研 究结果支持了基于MPER这一位点来设计免疫原。但是值得注意的是, Verkoczy等[26]报道单抗4E10和2F5跟脂类可以发生反应, 基于B细胞的耐受机制的考虑, 已经提出该类抗体可能很难通过疫苗诱导。Alam等[27]近期分析了单抗2F5和4E10的分子作用, 两个单抗都带有长的具有疏水面的CDRH3环, 该环背对肽表位。他们发现 4E10的残基能可逆介导与病毒膜的吸附, 并且该疏水残基对中和是重要的, 但却并非是跟 gp41的相互作用。这些研究结果直接影响 了为合理设计基于gp41的近膜端外部区的HIV-1包膜免疫原的策略。

3.3 新发现的单抗带来免疫原设计的新认识

新近发现了两株单抗PG9和PG16。这些抗体识别的表位主要位于 gp120 上V1/V2 和 V 3 环保守的区域, 该表位主要呈现于三聚体的Env蛋白上。两株单抗可中和较大范围的HIV-1毒株[15,28], 并在约比先前认为的广谱中和单抗 (bNAbs)浓度低10~100倍的情况下起作用, 而这样的浓度极易通过疫苗方式达到。当前正在探索的疫苗策略之一是聚焦于三聚体刺突物的可变环保守的区域所引发的免疫响应上。有效的针对三聚体特异的广谱中和单抗的鉴定再次促使人们认识到了作为免疫原的单体 gp120 的有限性。同时也强调了产生功能类似于三聚体刺突状结构的重要性。随着研究的深入, 这些结果帮助在疫苗设计上理清思路, 引导更加合理的免疫原设计原则。

近来, Wu等[29]研究发现了三株广谱中和抗体VRC01, VRC02, VRC03。VRC01中和约 91% 的当前流行的HIV-1病毒株, VRC02 中和与VRC01相似。但VRC03与VRC01 和VRC02相比中和幅度相对较低, 只中和 57% 的病毒株。其他单抗也能够中和HIV-1, 但是没有一株单抗在广谱性和有效性方面可以跟 VRC01 和 VRC02这两株单抗相比的, 包括最近分离的CD4bs单抗HJ16也仅中和约 40% 的病毒株。Zhou等[30]研究揭示单抗VRC01在进入gp120上的CD4结合位点(CD4bs)部分模拟了CD4跟gp120相互作用的机制, 这解释了他们的广谱反应性(由于所有的HIV-1分离株在进入细胞时必须依赖于其受体CD4)。值得注意的是, 这些单抗分离于感染 HIV-1 B亚型病毒株的感染者, 但是显示了可中和大多数遗传亚型 不同的HIV-1的病毒株的中和活性, 这表明他们识别的是Env上功 能保守的表位。同时也揭示了该类抗体可以在人体中被诱导产生。这些抗体的发现使人们提出了新的思考: 人的免疫系统是如何产生该类抗体, 以及相关的机制如何?

3.4 结构研究为免疫原设计带来新的视角

Liu等[31]使用冷冻电镜X射线断层扫描技术结合三维图像分别报告了未带配基状态的天然HIV-1三聚体结构[32-33], 与广谱中和抗体 b12形成复合物的结构, 以及 CD4 的三元复合物结构和17b抗体的结构, 他们获得了未带配基的天然的HIV-1gp120 三聚体分子模 型, 以及被CD4束缚状态的模型。结果证明了结合CD4导致了Env三聚体重要的重组, 造成了外部的旋转和每一个gp120单体的位移。这些变化与沿着三聚体中心轴的gp41区的重排相结合, 导致了病毒和靶细胞膜之间进一步的接触。这些发现阐明了三聚体HIV-1gp120结构和构象的变化与抗体中和以及与靶细胞的吸附之间的相互关系。基于结构信息可能帮助更好地模拟天然HIV-1表面刺 突状结构的重组三聚体的设计。

HIV-1 gp120 上的结合CD4 的位点 (CD4bs)是容易被抗体攻击的, 但是大多数与此位点结合的抗体并不具有中和HIV-1的能力。近来有文献报道了这一限制的分子机理[34]。F105和b13是两个与 CD4bs结合的并具有弱中和作用的抗体, 通过F105和b13分别与 gp120复合物的共结晶的结构研究发现, 尽管这两株抗体同 CD4 或广谱的结合CD4bs中和抗体b12接近gp120的角度相似。然而, 在识别上的细小差别导致了这两株单抗限定的gp120构象与b12 所限定的 gp120 的构象存在实质上的差异。模型和结合实验揭示了该构象与病毒刺突状结构不一样。除识别靶标更精确的抗体外, 在CD4bs识别上的这些细小不同致使HIV-1能够耐受所有其它的抗体的中和作用。该项研究从结构生物学角度认识了广谱中和抗体和非广谱中和抗体中和作用差异的分子基础。

4 讨论

在抗HIV-1感染中, 传统的疫苗途径在诱导有足够广度和有效性的抗体方面已经失败，所以，设计方向转向其他疫苗设计策略上, 特别是基于结构信息的合理的疫苗设计策略上。尽管在Env抗原性和免疫原性两者之间的关联性方面这些途径已提供了视角和希望, 但是聚焦到保守表位的免疫原依旧难以琢磨。然而, 近来技术的突破和科学的进步已经重新点燃了基于抗体的疫苗设计的希望。新中和抗体的分离和他们表位的特性的认识应该成为HIV-1疫苗发展的首要选择。新技术的运用已经帮助人们分离到源于感染HIV-1病人血清中的具有广谱中和作用的单抗 [35-36]。高分辨率的结构信息能够揭示原子水平的Env结合Nab区域的精细的结构信息, 这些信息能够用来设计更好的免疫原。近来一些令人鼓舞的研究提供了证据表明体液免疫系统能够产生有效的和具有交叉反应的Nab。对这些血清中和抗体表位的认识, 伴随着Nabs跟它们的靶点表位的细节结构信息认识，这些信息将帮助人们在疫苗免疫原设计中找到一种合理的方法。

参考文献