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【中信证券医药田加强团队】医疗科技创新系列研究之一：蛋白降解药物
2019年3月20日，《Nature》发表名为“The protein slayers”的文章，给本已十分 火热的蛋白水解靶向嵌合体（Proteolysis-Targeting Chimeras，PROTACs）技术再添一把火，这一技术平台也吸引了罗氏、辉瑞、默克、 诺华等生物巨头公司数十亿美金的投资，那PROTACS到底是什么，较现有的药物具有怎样的优势，发展的历程和未来的展望如何，让我们先从泛素-蛋白酶体降解通路谈起。
从泛素-蛋白酶体蛋白降解途径谈起
在细胞内，基因通过转录翻译成氨基酸链，其正确折叠后形成功能蛋白。在折叠错误或新陈代谢需要的情况下，蛋白可以通过自噬-溶酶体或泛素-蛋白酶体途径被降解清除。泛素-蛋白酶体途径主要由三种酶调控：泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3。E1首先与泛素分子（Ubiquitin，Ub）结合，随后Ub转移到E2上，连接着Ub的E2随后和E3形成复合物，其能够特异性地结合并转移Ub到需要降解的蛋白上，而与Ub结合（被泛素化）的靶标蛋白可以被称为“蛋白粉碎机”的26S蛋白酶体降解。这一系列反应完成后，E1、E2、E3将被回收利用并参与降解下一个致病蛋白。由于泛素-蛋白酶体途径的重要生物学意义，2004年的诺贝尔化学奖也被授予了这一领域的先驱。
PROTACs的发展历程：分子量不断减小
在泛素-蛋白酶体途径发现后，科学家希望通过模拟体内蛋白降解过程清除致病蛋白，其中利用E3连接酶而开发的定向诱导蛋白泛素化降解的PROTACs（PROteolysis-TArgeting Chimeras）受到大家广泛关注。PROTACs主体包括3部分：结合靶标蛋白的配体、结合E3泛素酶的配体和连接两端配体的linker。通过两端的配体将靶标蛋白和E3连接酶结合到一起，然后通过E1、E2、E3 的作用将泛素分子添加到靶标蛋白，并通过26S蛋白酶体将靶标蛋白降解。
PROTACs 方法主要归功于科学家 Craig M. Crews 和 Raymond J. Deshaies。他们在2001年提出PROTACs 的概念，并合成了嵌合分子protac-1，它由SCFβ-TRCP、磷酸肽和一个小分子ovalicin组成。在爪蟾细胞的提取物中，Protac-1成功降解了MetAP-2，证明了PROTACs 定向降解靶标蛋白的可行性；2003年，科学家又研制出了雌激素受体（ER）和雄激素受体（AR）的 PROTACs，其中ER、AR分别是乳腺癌和前列腺癌的药物靶点。
虽然PROTACs取得了很大进展，但在这一阶段与PROTACs连接的E3酶是SCF，人们只能找到一个带有磷酸化丝氨酸修饰的十肽与之连接，其体积庞大到无法自行透过细胞膜。为了给PROTACs“瘦身”，2004年Schneekloth、Crews等科学家选择了一种新的E3酶VHL，且发现一个不带磷酸化修饰的七肽结构与之连接。这样改造之后的PROTACs终于能够勉强透过细胞膜了。
但由于分子量依然较大，PROTACs进入细胞后很容易被当作外来物而被排斥，直到2008年第一个小分子PROTACs被报道，这一问题才得到解决。科学家用PEG-based linker代替了肽段，很大程度上减小了PROTACs分子大小，并且合成的SARM-PEG based linker-MDM2的小分子PROTACs成功降解了雄激素受体（AR）。
随后越来越多能与E3酶连接的小分子被发现，比如2010年发现小分子Bestatin能连接E3酶cIAP，小分子Thalidomide能够连接E3酶CRBN等等。在此基础上，2015年的5月和6月PROTACs成果井喷式涌现，Bradner、Ciulli 和Crews三位PROTACs领域大牛领衔的团队共发表5篇独立论文，这些新设计的小分子PROTACs在离体培养细胞和小鼠动物模型上都表现出了显著的治疗效果，进一步说明了PROTACs的成药潜能。目前为止共有30多个功能小分子PROTACs被报道。
PROTACs的优势：具有靶向不可成药蛋白的潜能
因两端配体的多样性，PROTACs几乎可以靶到所有目标蛋白。且泛素-蛋白酶体降解系统中的E3连接酶可以重复利用，因此与传统的小分子制剂以及单抗类药物相比，小分子PROTACs展现出了多种潜在优势。
首先，PROTACs具有靶向不可成药蛋白的潜能。目前已知约3000种和疾病相关的蛋白，其中仅约400种有药物靶向，主要原因包括：1）单抗类药物：分子量太大，难以进入细胞，只能靶向细胞表面蛋白；2）小分子抑制剂：主要是通过抑制蛋白质的生物活性来发挥作用，但是人体内的大多数蛋白并没有活性位点。而对于PROTACs，理论上只要能够和靶蛋白结合就可发挥作用，且PROTACs分子量已经显著减小，可以进入细胞膜发挥作用。因此其可靶向蛋白的种类较现有疗法大为增加。
其次，相比小分子抑制剂，PROTACs的效率有望更高。小分子抑制剂采取的是竞争性抑制机制，通常需要很高的浓度才能和靶点充分结合，副作用较大。而PROTACs降解蛋白后还可以循环利用，因此需要的剂量较低，效率更高。
但另一方面，PROTACs高效率也伴随着潜在风险，PROTACs一旦脱靶，副作用可能较为明显，因此研发过程中应更加重视对其毒理药理的监视评估。
PROTACs的研发进展：最快处于临床I期
国外目前有多个专注于PROTACs技术的新锐公司，研发进展靠前的包括Arvinas、C4 Therapeutics、Kymera Therapeutics等。
Arvinas公司于2013年成立，是推动小分子PROTACs成药最快的公司，2018年Arvinas在纳斯达克成功上市，主要创始人是Crews。目前全球仅有的两款获得FDA审批进入试验的PROTACs药物均为来自Arvinas公司，分别是ARV-110（靶向AR，用于去势抵抗性前列腺癌的治疗）以及ARV-471（靶向ER，用于晚期、转移性ER+/HER2-乳腺癌的治疗，目前均在临床I期。临床前数据显示。其中ARV-110较恩杂鲁胺相比用药量更低，且可降低对“恩杂鲁胺”有耐药性的 VCaP 癌细胞70%的生长。除了肿瘤治疗，神经系统疾病也是Arvinas公司的研发重点，靶向阿尔茨海默症靶点Tau和帕金森靶点α-synuclein 的PROTACs均处于早期研发阶段。
C4 Therapeutics公司成立于2015年，创始人之一是PROTACs领域大牛之一James Bradner教授。C4 Therapeutics的研发方向也主要集中在肿瘤和神经系统疾病这两方面。值得一提的是， Arvinas和C4 Therapeutics公司分别建立了快速分析蛋白降解的系统，HaloPROTACs和dTAG，可以帮助研究人员快速观测蛋白降解后的影响，加速蛋白靶点的筛选。目前这两个系统已经被上百个学术实验室使用。
Kymera Therapeutics公司成立于2015年，主要研究方向为肿瘤和免疫系统疾病。公司首选的药物靶点为在肿瘤、自身免疫疾病中都发挥着关键作用的蛋白IRAK4。公司目前研发进度最快的两种PROTACs药物均靶向此靶点。
从创始人或股东来看，这三家公司都有着一些联系。PROTACs技术的开拓者为Deshaies和Crews，其中Crews是Arvinas公司的主要创始人，而Deshaies现任Amgen公司的全球研究副总裁，Amgen公司又参与了Kymera Therapeutics公司的A轮融资。Bradner团队和Ciulli团队近年来也为PROTACs的发展做出了卓越的贡献，其中Bradner是C4 Therapeutics公司的主要创始人，而Ciulli现在和德国医药公司Boehringer Ingelheim合作，致力于扩大PROTACs中可使用的E3酶库。值得一提的是，Ciulli曾到Crews的团队做过访问学者，Bradner团队的主力人员Buckley又曾是Crews的研究生。
PROTACs的未来：机遇与挑战并存，期待初步临床结果
由于PROTACs具有降解几乎一切蛋白靶点的潜能，因此其有望颠覆小分子药物的研发模式，也受到业界的广泛关注。但不可否认的是，PROTACs药物离真正上市和大规模的临床应用，还有较长的路要走，还有不少挑战需要去面对。
首先，目前大家常用的PROTACs系统多为E3酶VHL和CRBN，配体结合验证过的E3酶一共仅5、6种。考虑到E3酶数量多达600种、且不同的酶将导致PROTACs的不同结构、不同代谢活性等，PROTACs的E3酶系统的选择还需要进一步扩展。
其次，目前PROTACs的靶蛋白基本仍是原来已经发现的药物靶点，如Arvinas进展最快的ARV-110和ARV-471分别靶向ER和AR这两种常见靶点。PROTACs可靶向多种不可成药蛋白的优势尚未真正体现。
最后，也最关键的是，PROTACs的研究目前基本都在细胞或者动物模型水平上进行的，在临床试验过程中疗效是否能够得到验证仍然是一个未知数，且一旦脱靶是否会产生严重的副作用也需要严密观察。预计目前进展最快的ARV-110将在2019Q4、2020H1得到初步和完整的临床数据，临床结果的好坏或许将影响着市场对于PROTACS发展的态度和判断。
参考文献
1, Sakamoto, K. M., Kim, K. B., Kumagai, A., Mercurio, F., Crews, C. M., & Deshaies, R. J. (2001). Protacs: Chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98(15), 8554–8559.
2, Sakamoto, K. M., Kim, K. B., Verma, R., Ransick, A., Stein, B., Crews, C. M., & Deshaies, R. J. (2003). Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular and Cellular Proteomics, 2(12), 1350-1358.
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