张人和，韩双印
（郑州大学人民医院，河南 郑州 450003）
摘 要：嵌合抗原受体修饰 T 细胞（CAR-T）治疗是一种通过基因编辑表达跨膜嵌合抗原受体并重新导向 T 细胞特异性的基因治疗方法。近年来不断累积的临床数据证实了 CAR-T 细胞在血液系统肿瘤治疗中的安全性与有效性。实体肿瘤的生物学特性更为复杂，高肿瘤异质性等特点使CAR-T细胞的靶点选择充满挑战。研究者们正在不断探索实体肿瘤恶性表型所必需的合适靶点、寻找最佳抗原组合和治疗方案，目前已有一些实体肿瘤靶点在临床试验中展示了良好的结果。全文根据目前CAR-T细胞治疗实体肿瘤的临床试验结果，就实体瘤靶点选择的临床进展作一综述。
主题词：实体肿瘤；嵌合抗原受体修饰 T 细胞；靶点
中图分类号：R730.5 文献标识码：A
Research Advances in Target Selection of CAR-T Cells Therapy for Solid Tumors
ZHANG Ren-he，HAN Shuang-yin
（People’s Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450003，China）
Abstract：Chimeric antigen receptor-modified T cell(CAR-T) therapy is a kind of gene therapy. CAR-T cells are prepared by gene editing, and expresses transmembrane chimeric antigen receptors redirecting T cell specificity. The accumulated clinical data in recent years has demonstrated the safety and efficacy of CAR-T cells in the treatment of hematological malignancies. The biological characteristics of solid tumors are more complex, and the high tumor heterogeneity leads to a more challenging antigenic target selection. Immunologists are exploring the appropriate targets indispensable for the malignant phenotype of solid tumors, finding the best antigen combination and therapeutic regimen, some of which have shown promising results in clinical trials. Based on the recent clinical trials of CAR-T therapy, this review summarizes and further discuss the advances in targets selection of CAR-T therapy for solid tumors.
Subject words：solid tumors；chimeric antigen receptor-modified T cell；targets
免疫治疗是近年来肿瘤医学研究中的一大热点，旨在利用机体免疫细胞的活性，对含某种抗原表型的恶性肿瘤特异性地杀伤。嵌合抗原受体修饰T细胞（chimeric antigen receptor modified T cell，CAR-T） 细胞免疫治疗将抗原抗体识别特异性和 T 细胞潜在的杀伤能力相结合，使 T 细胞具有新的肿瘤靶向性、杀伤活性和持久性[1]。近年来，CAR-T 细胞免疫治疗在血液系统肿瘤中的成功备受关注。CD19 靶向的 CAR-T 细胞用于治疗难治性粒/淋巴细胞白血病和多种B细胞淋巴瘤，并在临床试验中显示出惊人的完全缓解率（complete remission, CR）和疾病稳定率（stable disease，SD）[2]。CAR-T 细胞治疗主要应用血液肿瘤。实体肿瘤比血液系统肿瘤更为复杂，如何选择合适的CAR-T细胞靶点是研究者面临的挑战。
CAR-T 细胞靶点分为两 类：肿瘤特异性抗原（tumor-specific antigen, TSA）和肿瘤相关性抗原（tumor-associated antigen, TAA）。由于肿瘤特异性抗原较为缺少，目前报道的实体肿瘤 CAR-T 细胞临床试验大多都围绕着肿瘤相关性抗原构建，其中包括间皮素（mesothelin, MSLN）、神经节苷脂 2（GD2）、人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, Her-2）、 癌胚抗原（carcinoembryonic anti- gen, CEA）、前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen，PSMA）等[3]。随着不同靶点 CAR- T 细胞临床试验的进展，实体瘤中的肿瘤靶点选择被认为有更多重要的作用。
1 实体瘤 CAR-T 细胞靶点的选择原则
CAR-T 细胞治疗实体瘤的一大关键问题在于实体肿瘤的抗原表达具有高异质性， 其不仅表现在肿瘤内（肿瘤内异质性）和患者间（肿瘤间异质性），治疗前后、原始与复发病灶之间也可能不同[4]。部分细胞更容易产生抗原逃逸，抗原阴性表达的肿瘤细胞逃逸免疫攻击并致使复发[5]。理想情况下，一个在肿瘤中稳定并高表达的个体化靶点是实体瘤 CAR- T 细胞治疗的目标[4]。另一方面，靶点的特异性对 CAR-T 细胞治疗不可缺少。历史上，低特异性的靶点识别 CAR-T 实体瘤治疗产生过 1 例毒性事件，2010 年，在靶向 Her-2 的 CAR-T 细胞治疗结肠癌的临床试验中，由于患者正常肺组织中也表达 Her-2 抗原，CAR-T 细胞对患者正常肺 组织进行攻击，患者很快出现了呼吸窘迫，并在15 天后死亡[6]。现有大部分实体瘤靶点的正常表达通常局限在非重要脏器的上皮，表达程度低，这些抗原构建的 CAR-T 细胞也在临床试验中显示出对正常组织程度极轻的影响[7]。由此可见，靶点的选择应该在特异性和效力上达到一个很好的平衡，实现T细胞杀伤作用的同时，确保治疗安全性。此外，单链抗体的抗原亲和力、表达密度等特性影响 CAR-T 细胞激活，与触发细胞溶解活性(溶解阈值)相比，诱导细胞因子产生和细胞增殖(激活阈值)需要更高的结合密度，选择抗体亲和力合适的抗原表位的是诱导CAR-T细胞毒性的关键[8]。B 细胞起源的血液系统肿瘤中 CD19 的表达接近100%，其良好的特异性和表达量推动了 CAR-T 细胞在血液系统肿瘤中的成功。目前，CAR-T 细胞临床研究结果展现了一些很具潜力的实体瘤靶点，为 CAR-T 细胞攻克实体肿瘤提供了广阔思路。
2 实体瘤 CAR-T 细胞靶点
2.1 间皮素
间皮素（mesothelin，MSLN）分子量约为 40000Da， 是一种锚连在膜表面的糖蛋白， 因在正常组织间皮细胞中表达而得名[9]。MSLN 在肿瘤中的表达非常广泛，约有 95%恶性间皮瘤，80%~85%胰腺癌，68.8% 卵巢癌和53%肺癌表达MSLN[10]。MSLN 高表达调控了多种细胞信号通路，并与肿瘤增殖、侵袭和不良预后有密切联系。MSLN 也是三阴性乳腺癌特征性标志物，而三阴性乳腺癌对单抗药物几乎无敏感性，MSLN CAR-T 细胞有望成为三阴性乳腺癌仅有的免疫治疗药物[9]。MSLN靶向的CAR-T 细胞最早在2011年由 Beatty 等利用电转mRNA 的方式制备，这 种通过 mRNA 短暂表达CAR 分子的 CAR-T 细胞较大降低了 CAR-T 细胞对正常组织的安全风险，他们也在后续的Ⅰ期临床试验中证明了这种设计的安全性，同时包括反应的持续性[11]。2018年，Beatty 团队报道了一项Ⅰ期临床试验的结果：6 例胰腺癌患者接受了 MSLN CAR-T 细胞治疗，均出现了各自不同的抗肿瘤反应，2 例患者获得了 3.8 个月和 5.4 个月的 SD 反应， 其中 1 例患者的肿瘤组织活跃代谢信号下降了 69.2%，且肝转移灶全部消失[12]。目前有多项 MSLN CAR-T 细胞的临床试验正在进行，并在探索不同的转导方式和联合治疗模式对 MSLN CAR-T 细胞效力的影响。
2.2 神经节苷脂 2
神经节苷脂2 （diasialoganglioside2, GD2）是一种双唾液酸神经节苷脂，正常表达在外周神经元和部分中枢神经系统上，起到促进细胞间粘附的作用[13]。在神经母细胞瘤中和黑色素瘤中 GD2 表达大幅上调，并可达到100%的表达率（神经母细胞瘤）。GD2 在临床上用作血液检测的肿瘤标志物，可以鉴别神经母细胞瘤的良恶性[14]；GD2 也被用做神经母细胞瘤单克隆抗体治疗的靶点，2015年GD2 单抗产品Unituxin被美国FDA批准用于高危险 度神经母细胞瘤的临床治疗。Louis 等第一次构建了 GD2 靶向的 CAR-T 细胞治疗神经母细胞瘤，该实验也成为了 CAR-T 细胞治疗实体瘤中的经典实验[15]。为了提供共刺激源，他们将患者自体 EB 病毒反应性T细胞也作为 CAR-T 细胞的构建载体。对比表达 GD2 CAR 的普通外周血单个核细胞（PBMC）细胞，他们证明了 EB 病毒的共刺激可以提高 CAR-T 细胞的持续性。Ⅰ期临床试验结果显示，19 例患者中有 3 例患者获得了完全缓解，也未观察到除了轻度疼痛之外的明显不良反应[15]。2016 年，在贝勒医学院公布的 一项 GD2 CAR-T 细胞临床试验的结果中，11例神经母细胞瘤患者中有 5 例获得 SD，经后续补充治疗 2 例获得 CR；试验未观察到明显毒副反应[16]。目前 GD2 CAR-T 细胞在实体瘤中的疗效最为显著，并有希望成为进入Ⅲ期临床试验，成为第一个进入 Ⅲ期临床试验的实体瘤 CAR-T 细胞靶点。
2.3 癌胚抗原
癌胚抗原（carcinoembryonic antigen CEA）是一种膜表面酸性糖蛋白，是胃肠道肿瘤和一些腺癌的常规血清学标志物，在超过 75%胰腺癌、60%结直肠癌中表达[17]。CEA 表达也出现在正常黏膜腔内，但局限在上皮层细胞上；肿瘤中 CEA 表达失去这种极性而出现在每个肿瘤细胞表面，并起到促进肿瘤细胞粘附、侵袭的作用[18]。在Hawkins等的临床试验中（NCT01212887），14 例复发转移的胃肠肿瘤患者接受了 CEA CAR-T 细胞合并 IL-2 注射的治疗， 在注射剂量递增模式下，7 例患者获得 SD[19]。第三军医 大学钱程教授团队报道了 CEA CAR-T 细胞在10例晚期结直肠癌患者中的应用，7 例患者获 SD，其中 2 例出现明显肿瘤缩小， 所有患者均观察到血清 CEA 不同程度下降[20]。CEA CAR-T 细胞的安全性已经得到了普遍验证，如何提高CEA CAR-T 细胞的持续性和抗肿瘤活性是未来的研究方向。
2.4 人表皮生长因子受体-2
人表皮生长因子受体-2（Her-2）是一种大分子的Ⅰ型跨膜蛋白，又称ErbB2，是 ErbB 受体家族的一员。Her-2 可以与 ErbB 家族其他受体如EGFR 结合形成同源或异源二聚体，调控细胞间信号通路，促进细胞增殖、血管生成和肿瘤的发生发展[21]。Her-2 最早在乳腺癌中研究，乳腺癌中基因突变容易导致 Her-2 阳性，并且 Her-2 高表达量与肿瘤低预后、低无病生存期有关；Her-2 也高表达在部分膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌和非小细胞肺癌中[22]。Her-2 CAR-T 细胞的早期临床试验陷入了致死性不良反 应的困境，后续Her-2 CAR-T 细胞研究注重了安全设计，通过例如靶向双靶点，减少共刺激分子以及剂量递增注射等方式增强安全性及有效性。Hegde 等在成胶质细胞瘤（GBM）小鼠模型上构建了 Her-2 和 IL-13Rα2 双靶点 CAR-T 细胞，原位移植的 GBM 小 鼠模型的中位生存期超过 160 天[23]。2016年，贝勒大学医学院公布了一项Ⅰ期临床试验结果，17 例转移性肉瘤患者以剂量递增的方式接受了Her-2 CAR-T 细胞的注射，4 例患者获 SD， 其中 1 例患者肿瘤坏死面积大于 90%[16]。2017 年，在美国一项Ⅰ期临床试验中，17 例接受 Her-2 CAR-T 细胞注射的进展期 GBM 患者有 1 例患者获得部分缓解（PR），7 例患者获得 SD，治疗组患者平均中位生存期为 11.1 个月， 从诊断 GBM 为开始的中位生存期平均为 24.5 个月[24]。目前全球范围内有13 项进行中的 Her-2 CAR-T 细胞临床试验，未来可以期待包括联合治疗、串联双靶点在内的新策略在Her-2 临床试验中的实践效果。
2.5 前列腺特异性膜抗原
前列腺特异性膜抗原（PSMA）基因定位于11p11-12，表达由 750 个氨基酸组成的Ⅱ型固有膜蛋白[25]。PSMA 在正常前列腺组织中较高表达[26]，同时在乳腺、肾、结肠和肝细胞少量表达[25]。在一些腺癌当中，包括前列腺癌、非小细胞肺癌和肾癌，PSMA 表达上调，并有促进肿瘤侵袭转移的功能，是肿瘤不良预后的预测因素[26]。2016 年，Richard等报道了一项PSMA CAR-T 细胞的Ⅰ期临床试验结果，5 例前列腺癌患者中，2 例患者获得了部分缓解（PR），伴有血清学前列腺特异性抗原（PSA）下降；未观察到 PSMA CAR-T 细胞引起的毒性反应[27]。PSMA在前列腺癌中理想的特异性和安全性值得关注，宾夕法尼亚大学 Carl H. June 团队在 2018 启动了一项 PS- MA CAR-T 细胞的Ⅰ期临床试验，该试验构建了一 种显性抑制 TGFβ 受体表达的 PSMA CAR-T 细胞，增强 CAR-T 细胞效力，并通过临床前试验证明了其有效的抗肿瘤效应[28]。
2.6 磷脂酰肌醇聚糖 3
磷脂酰肌醇聚糖3（glypican3, GPC3）是一种膜表面硫酸肝素乙酰蛋白多糖（heparan sulfate pro-teoglycan, HSPG），分子量 约为65000Da，在正常细胞表达较少[29]，GPC3 起到调控细胞外基质生长和细胞分化的作用。GPC3在肝细胞癌或卵巢透明细胞 癌，卵黄囊癌等生殖系统肿瘤中表达，其在肝细胞癌中的表达率达 74.8%， 而在正常肝组织内几乎无表达，成为肝癌 CAR-T 治疗新的理想靶点[30]。从2014年起，上海交通大学仁济医院团队分别在肝细胞癌细胞系、SCID小鼠、PDX 小鼠上证明了 GPC3 CAR-T 细胞对肝细胞癌的特异性杀伤[31-33]；2018 年该团队在 ASCO 大会上发表了其Ⅰ期临床试验的初步结果，其中13例肝细胞癌患者接受GPC3 CAR-T细胞的治疗，1例患者获 PR，2 例患者获 SD，所有试验患者均显示出对 CAR-T 治疗的耐受[34]。目前有多项治 疗肝细胞癌的 GPC3 CAR-T 细胞Ⅰ期或Ⅱ期临床试验在中国进行（NCT02876978，NCT03198546）。
2.7 黏蛋白 1
黏蛋白1（MUC1）是一种大分子跨膜糖蛋白，是最早发现的黏蛋白家族分子，由胞外域、跨膜域和胞内域三部分非共价连接而成[35]。MUC1的胞内域有多个磷酸化位点，能通过影响胞内信号通路的传递，在肿瘤中起到促进肿瘤增殖、侵袭和转移的作用[36]。MUC1 胞外域非常特殊，在正常细胞中，MUC1 胞外 域大量糖基化，MUC1 胞外域主干分子结构被糖基 化遮挡；在肿瘤细胞中，由于糖基转移酶等酶的异常 表达，MUC1 糖基化减少或变异，暴露了原有的主干分子结构并形成新的短小糖链结构。这种性质使得 MUC1 在肿瘤中的表达和正常细胞不同，具有很高的特异性。Posey 团队是最早构建肿瘤 MUC1 靶向的 CAR-T 细胞的团队之 一，2016 年，Posey 团队通过细胞实验和动物实验，显示出 MUC1 CAR-T 细胞对人正常组织的没有反应，而对多种肿瘤细胞包括胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和白血病细胞有识别杀伤作用 [37]。国内杨林教授团队最近报道了 1 例 MUC1 CAR-T 细胞治疗精索细胞癌的临床试验，患者出现了肿瘤缩小和瘤灶内坏死，试验中无明显不良反应发生[38]。
2.8 其他抗原
EGFRvⅢ是 EGFR受体的突变体， 作为少有的肿瘤特异性抗原，在GBM、非小细胞肺癌等肿瘤的治疗中有较好的前景[39]。IL-13Rα2 是过表达在GBM上的一种高亲和力单体受体，靶向 IL-13Rα2 的 CAR-T 细胞临床试验观察到了肿瘤坏死和IL- 13Rα2 表达降低[40]。上皮细胞激酶 2（EphA2）是一 个较新的 CAR-T 细胞靶点，在非小细胞肺癌、GBM上过表达，EphA2 CAR-T 细胞 在原位移植的 GBM SCID 小鼠模型中取得了良好的效果[41]。靶向细胞外基质是 CAR-T 治疗的新思路，成纤维细胞激活蛋白 (fibroblast activation protein, FAP) 是一种与胞外基质重塑相关的丝氨酸蛋白酶，其高表达于癌相关成纤维细胞表面[42]，靶向 FAP 蛋白的 CAR-T 细胞与靶向肿瘤细胞表面抗原的 CAR-T 细胞联合治疗，能减少肿瘤抑制微环境的影响，增强 CAR-T 细胞对实 体肿瘤的杀伤力[42]。
3 CAR-T 细胞靶点选择的新策略
CAR-T 细胞治疗实体瘤的挑战与机遇并存，研究者们正在不断探索 CAR-T 细胞靶点选择的新策略。靶向多靶点的 CAR-T 细胞是被广泛研究的构建方法，多靶点的覆盖可以提高 CAR-T 细胞杀伤肿瘤细胞的比例，增加肿瘤细胞的清除预期，有望提高患者的生存获益[43]。但抗原逃逸仍是多靶点 CAR-T 细胞需要面对的问题：临床试验中多靶点覆盖的CAR- T细胞也会引起抗原逃逸，引起治疗耐受。抗原扩展或表位扩展是是实体瘤 CAR-T 治疗的新对策，其利用免疫治疗对肿瘤细胞的杀伤后产生的新抗原，激活新的特异性或非特异性免疫，增强对肿瘤残余病灶的杀伤[44]。适配器肽可以连接肿瘤细胞和 CAR-T 受体，适配新型抗原表位，提供无需更新 CAR-T 谱系的新方法[45]。增强 CAR-T 细胞的非特异性杀伤是 减少抗原逃逸的一种思路，有研究者构建了分泌非特异性杀伤所 需的细胞因子，如 IL-12、IL-15 或 TGF-β 的 CAR-T 细胞，并在临床前试验中显示出了更高的肿瘤清除率[46]。
CAR-T 细胞的靶点选择是构建 CAR-T 细胞关键的第一步，CD-19 CAR-T 细胞在血液系统肿瘤中的成功很大程度上归结于 CD-19 良好的特异性和表达量， 靶向其他血液肿瘤抗原例如 CD-33、CD-20 的 CAR-T 细胞都显示出不如 CD-19 CAR-T 细胞的效力。目前 CAR-T 细胞在实体肿瘤中的应用仍处于起步阶段，靶抗原的选择应该注意抗原在正常组织中的表达以及抗原的表达范围，除此之外，还需进一步优化 CAR-T 细胞自身结构设计和有效性，探索最 佳的抗原或抗原组合和对应其最适合的实体肿瘤类型，提升CAR-T 对实体瘤的整体疗效。如今，实体肿瘤的靶点选择呈现一个多元化的现状，这是由实体肿瘤丰富的异质性决定的，随着抗原合成、筛选、构象分析等技术的发展和肿瘤靶抗原的推陈出新，未来的实体肿瘤靶点将朝着更加多元化的方向发展。
参考文献
冠勤医药2007年成立于天津市滨海新区，旗下设有冠勤医药（广州）有限公司、北京、济南、郑州、上海、成都等办事处，是中国活跃的提供临床前及临床服务的综合型CRO公司。
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