斑蝥酸钠抑制人肝癌HepG 2细胞增殖及其机制的研究

肝癌是常见的恶性肿瘤，早期手术切除是其治疗的关键，但多数患者就诊时已属晚期，丧失手术时机，因此非手术疗法在晚期肝癌的治疗中仍占据重要地位。斑蝥酸钠是从斑蝥中提取并合成的一种抗癌新药，目前已广泛应用于肝癌、食管癌、胃癌及贲门癌等的治疗中，而其确切的抗肿瘤机制仍不明确。本研究通过免疫细胞化学法、流式细胞术等技术观察斑蝥酸钠在体外对肝癌细胞HepG2的影响，并初步探讨其的作用机制。

肝癌细胞系HepG2购于重庆医科大学病理生理教研室。斑蝥酸钠注射液（贵州神奇制药有限公司），Survivin兔抗人多克隆抗体（BA1420,武汉博士德）， caspase-3活性检测试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒（南京凯基），SP-9001试剂盒、浓缩型DAB试剂盒（北京中杉），四甲基偶氮唑盐（Sig ma）、二甲基亚砜（Amresco）。

肝癌HepG2细胞在不同浓度斑 蝥酸钠干预后分别采用MTT法、流式细胞术、免疫细胞化学法、比色法等检测细胞增殖抑制率、细胞周期变化、Survivin蛋白表达和Caspase-3活性。

①斑蝥酸钠对HepG2细胞的增殖抑制作用 

MTT的结果表明斑蝥酸钠对HepG2细胞的抑制作用呈时间和剂量依赖性，细胞存活分数在不同浓度上存在差别（F=17.37，P<0.01），不同时间点上也存在差异（F=41.62，P<0.01），其存活率与时间、剂量均呈负相关（r值分别为-0.766和-0.606，P均<0.05），见图1。24、48、72h的IC50分别为（2.41 ±0.48）μg/ml。(0.72±0.08)μg/ml、（0.39±0.04）μg/ml。

②斑蝥酸钠对细胞周期的影响

斑蝥酸钠在干预后48h可以引起HepG2细胞G2/M期阻滞，随着药物浓度的加大，阻滞程度增强，G2/M期细胞比例与药物浓度呈正相关（r=0.993，P<0.01），见表1。

③斑蝥酸钠对Survivin蛋白表达的影响

对照组HepG2细胞中Survivin蛋白主要表达于胞核与胞浆中，其中胞核的表达比胞浆更强。药物干预以后，Survivin蛋白的表达明显降低，主要出现在胞浆中。斑蝥酸钠对Survivin蛋白的抑制率与药物浓度呈正相关（r=0.898，P<0.05）见图2。

④Caspase-3活性检测

从图3中可以看出斑蝥酸钠干预后HepG2细胞中Caspase-3的活性随时间和剂量的增加活性逐渐增强，在不同时间点上存在差异（F=28.18，P<0.05），不同药物浓度间也存在差别 （F=30.35， P<0.01），药物浓度与caspase-3活性呈正相关（r=0.854， P<0.01 ）。

斑蝥是从芫青科昆虫南方大斑蝥(大斑芫青)和黄黑小斑蝥（眼斑芫青）提取并合成的一种剧毒药品，其主要成分是斑蝥素，早在20世纪70年代，斑蝥素就曾试用于治疗原发性肝癌，结果显示其能缓解病情，提高1年生存率。而斑蝥酸钠作为近年我国研制的一种新型广谱抗癌药，它保持了斑蝥素特有的抗癌活性，毒副作用却较斑蝥素降低。我们将斑蝥酸钠在体外作用于人肝癌细胞系HepG2，采用MTT法观测细胞的存活率，发现斑蝥酸钠能显著的抑制细胞的增值，且呈时间、剂量依赖性。为进一步阐明斑蝥酸钠抑制HepG2细胞增殖的机制，我们从细胞周期角度进行深入研究：斑蝥酸钠在药物干预后48h使肝癌细胞出现了明显的G2/M期阻滞，表明斑蝥酸钠能延迟肿瘤细胞周期转化、减慢细胞增殖速率，从而抑制肿瘤细胞增殖。

通过细胞学水平的研究，我们证实了斑蝥酸钠对肝癌HepG2细胞增殖有明显的抑制作用，为肝癌治疗中药物的选择提供了科学的实验室依据。本次实验虽然对斑蝥酸钠的抗肿瘤机制做了相关阐述，但更深入透彻的作用机理还有待更进一步的探讨。